肝素是一類高度硫酸化的線性糖胺聚糖,具有抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗炎癥及抗腫瘤等作用,但研究表明,在肝素應(yīng)用的過程中常伴隨著很多不同的副作用,例如肝素誘導(dǎo)性血小板減少、過敏反應(yīng)等。相對來說,由普通肝素通過裂解得到的相對分子量較低的低分子量肝素和超低分子量肝素不僅具有更高的抗凝血活性,并且副作用更小,因此其研究與制備受到越來越多的關(guān)注。目前來說,低分子量肝素類產(chǎn)品主要是通過化學(xué)方法制備,該法處理效果過于激烈容易導(dǎo)致肝素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,失去生物活性。相比之下,肝素酶裂解法反應(yīng)條件溫和,不影響肝素本身的結(jié)構(gòu)特征,產(chǎn)物得率較高;反應(yīng)一步完成,且?guī)缀醪划a(chǎn)生雜質(zhì),比較利于下游的分離純化。因此,肝素類藥物的酶法生產(chǎn)研究具有重要的工業(yè)化應(yīng)用前景。肝素酶是一類能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀飧嗡睾土蛩犷惛嗡靥擒真I的蛋白質(zhì)。肝素酶裂解法生產(chǎn)肝素類藥物需要解決的關(guān)鍵問題是肝素酶來源狹隘以及酶制備成本高。因此,篩選高產(chǎn)肝素酶的新型微生物以及構(gòu)建高效表達可溶性肝素酶體系就顯得尤為重要。本課題正是基于以上問題,從自然界土壤中分離出產(chǎn)肝素酶的新型微生物——拉烏爾菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 肝素
        1.1.1 肝素的定義和結(jié)構(gòu)
        1.1.2 肝素的作用
        1.1.3 肝素的副作用
    1.2 低分子量肝素和超低分子量肝素
        1.2.1 低分子量肝素和超低分子量肝素的定義
        1.2.2 低分子量肝素的制備方法
        1.2.3 低分子量肝素和超低分子量肝素的質(zhì)量評價方法
        1.2.4 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢
    1.3 肝素酶
        1.3.1 肝素酶的來源及分類
        1.3.2 肝素酶的作用機理
        1.3.3 肝素酶活性的檢測方法
        1.3.4 肝素酶的應(yīng)用
        1.3.5 微生物產(chǎn)肝素酶的國內(nèi)外研究進展
    1.4 當(dāng)前肝素酶法制備肝素類藥物的瓶頸
    1.5 本論文的研究意義和主要內(nèi)容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
第2章 新型肝素酶高產(chǎn)菌的篩選與鑒定
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 樣品來源
        2.2.2 實驗試劑與儀器
        2.2.3 培養(yǎng)基
        2.2.4 肝素酶活的測定
        2.2.5 肝素酶高產(chǎn)菌的篩選
        2.2.6 肝素酶高產(chǎn)菌的菌種鑒定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 肝素酶高產(chǎn)菌的篩選
        2.3.2 肝素酶高產(chǎn)菌的菌種鑒定
    2.4 小結(jié)
第3章 發(fā)酵條件對Raoultella sp.NX-TZ-3-15 產(chǎn)肝素酶的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌種
        3.2.2 實驗試劑與儀器
        3.2.3 培養(yǎng)基
        3.2.4 培養(yǎng)方法
        3.2.5 肝素酶活的測定
        3.2.6 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化
        3.2.7 培養(yǎng)環(huán)境條件的優(yōu)化
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 培養(yǎng)基成分對Raoultella sp.NX-TZ-3-15 產(chǎn)肝素酶酶活的影響
        3.3.2 培養(yǎng)條件對Raoultella sp.NX-TZ-3-15 產(chǎn)肝素酶酶活的影響
        3.3.3 正交實驗
    3.4 小結(jié)
第4章 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 中肝素酶基因的克隆與表達
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗菌株和質(zhì)粒
        4.2.2 實驗試劑和實驗儀器
        4.2.3 培養(yǎng)基
        4.2.4 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 產(chǎn)肝素酶基因的確定
        4.2.5 無縫克隆與組裝
        4.2.6 重組工程菌的驗證
        4.2.7 重組工程菌的誘導(dǎo)表達
        4.2.8 重組工程菌表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析
        4.2.9 肝素酶活的測定
        4.2.10 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重組工程菌的誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化
    4.3 實驗結(jié)果與分析
        4.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 重組工程菌的驗證
        4.3.3 重組質(zhì)粒測序結(jié)果
        4.3.4 重組工程菌誘導(dǎo)表達結(jié)果
        4.3.5 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重組工程菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化結(jié)果
    4.4 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 課題展望
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果



本文編號：3824551