發(fā)布時(shí)間：2023-05-23 19:50

　　萜類(lèi)化合物是維持植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫所必需的重要物質(zhì),在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品以及工業(yè)上具有重要的商業(yè)價(jià)值。近年來(lái),萜類(lèi)代謝工程已成為植物次生代謝的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域,研究萜類(lèi)代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的功能具有重要的意義。HMGR是甲羥戊酸途徑上游調(diào)控萜類(lèi)合成的第一個(gè)限速酶,能夠?qū)⒁阴］o酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸。在高等植物中,HMGR基因常以基因家族的形式存在,其對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室前期從蘋(píng)果基因組中鑒定得到8個(gè)HMGR基因,本研究以此為基礎(chǔ),首先分析了蘋(píng)果HMGR基因家族成員在激素誘導(dǎo)和逆境脅迫下的表達(dá)模式,并成功克隆到MdHMGR5基因,然后構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,得到了過(guò)表達(dá)MdHMGR5轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。本研究對(duì)MdHMGR5基因的功能進(jìn)行了探究,主要研究結(jié)果如下:(1)激素誘導(dǎo)表達(dá)分析表明,蘋(píng)果HMGR基因家族不同成員呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。脅迫響應(yīng)分析表明,在低溫和機(jī)械傷害處理后,蘋(píng)果HMGR基因家族各成員均出現(xiàn)不同程度的上調(diào),表明蘋(píng)果HMGR基因可能參與到低溫和傷害脅迫的防御過(guò)程中。在氧化脅迫處理后,MdHMGR5基因的表達(dá)量上調(diào)最為顯著,推測(cè)該基...

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 植物次生代謝
    1.2 萜類(lèi)化合物概述
        1.2.1 萜類(lèi)化合物的種類(lèi)
        1.2.2 萜類(lèi)合成途徑及其交流
        1.2.3 萜類(lèi)化合物的功能和用途
    1.3 植物HMGR的研究進(jìn)展
        1.3.1 HMG-CoA還原酶及其催化機(jī)理
        1.3.2 HMGR蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.3 HMGR基因的克隆
        1.3.4 HMGR基因的調(diào)控及表達(dá)
        1.3.5 HMGR基因的生物學(xué)功能
        1.3.6 抑制劑對(duì)HMGR基因的影響
    1.4 萜類(lèi)代謝途徑相關(guān)酶
        1.4.1 異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)
        1.4.2 法呢基焦磷酸合酶(FPS)
        1.4.3 α-法尼烯合酶(AFS)
        1.4.4 1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)
        1.4.5 脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶(DXR)
    1.5 活性氧(ROS)清除系統(tǒng)
    1.6 本實(shí)驗(yàn)的目的意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 材料培養(yǎng)與處理
        2.1.3 載體與菌株
        2.1.4 酶與試劑
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 植物總RNA提取
        2.2.2 cDNA第一鏈的合成
        2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.4.1 基因克隆
            2.2.4.2 連接
            2.2.4.3 重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            2.2.4.4 菌落篩選
            2.2.4.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
            2.2.4.6 根癌農(nóng)桿菌GV3101 的制備
            2.2.4.7 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.5 MdHMGR5 蛋白亞細(xì)胞定位
        2.2.6 花浸法轉(zhuǎn)化擬南芥
        2.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
            2.2.7.1 基因水平鑒定轉(zhuǎn)基因植株
            2.2.7.2 qRT-PCR轉(zhuǎn)錄水平鑒定轉(zhuǎn)基因植株
        2.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥HMGR酶活性測(cè)定
            2.2.8.1 植物總蛋白的提取
            2.2.8.2 HMGR酶活性分析
        2.2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)抑制劑敏感性的測(cè)定
        2.2.10 轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)測(cè)定
            2.2.10.1 擬南芥種子萌發(fā)率和根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)
            2.2.10.2 相對(duì)含水量的測(cè)定
            2.2.10.3 丙二醛、脯氨酸含量和傷害程度的測(cè)定
            2.2.10.4 光合色素含量的測(cè)定
            2.2.10.5 過(guò)氧化氫含量和超氧陰離子自由基的測(cè)定
            2.2.10.6 DAB和 NBT染色
            2.2.10.7 抗氧化酶活性的測(cè)定
    2.3 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 蘋(píng)果HMGR基因家族表達(dá)分析
    3.2 MdHMGR5 與同源蛋白的聚類(lèi)分析
    3.3 MdHMGR5 基因組織表達(dá)模式分析
    3.4 MdHMGR5 基因克隆及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.5 MdHMGR5 蛋白亞細(xì)胞定位
    3.6 過(guò)表達(dá)MdHMGR5 擬南芥的鑒定
    3.7 過(guò)表達(dá)MdHMGR5 擬南芥HMGR酶活性的測(cè)定
    3.8 抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)和根長(zhǎng)的影響
    3.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化脅迫能力分析
        3.9.1 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)和根長(zhǎng)的影響
        3.9.2 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)及含水量的影響
        3.9.3 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥HMGR酶活性的影響
        3.9.4 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥光合色素含量的影響
        3.9.5 氧化脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥膜脂受傷害程度的分析
        3.9.6 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥活性氧積累的影響
        3.9.7 氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化酶活性的影響
        3.9.8 氧化脅迫后擬南芥萜類(lèi)代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析
4 討論
    4.1 蘋(píng)果HMGR基因家族表達(dá)模式分析
    4.2 MdHMGR5 基因組織表達(dá)模式分析
    4.3 過(guò)表達(dá)MdHMGR5 降低轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)抑制劑的敏感性
    4.4 過(guò)表達(dá)MdHMGR5 提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化能力
    4.5 過(guò)表達(dá)MdHMGR5 影響了擬南芥萜類(lèi)代謝途徑基因的表達(dá)
    4.6 保守基序缺失分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3822255