基因編輯技術(shù)指能夠定向改變目標(biāo)基因序列,從而對特定的DNA片段進(jìn)行敲除、插入等的技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)作為新一代基因組編輯技術(shù),與ZFNs、TALENs技術(shù)相比,具有操作簡便、結(jié)構(gòu)簡單、切割效率高、靶位點(diǎn)多等優(yōu)點(diǎn),在生物基因功能的研究方面和性狀改良方面能夠得到迅速推廣與應(yīng)用。本研究通過構(gòu)建pSCZ3-Cas9表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入玉米植株中,共獲得235個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。通過遺傳分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,篩選單染色體插入株系并檢測Cas9基因表達(dá)水平,選擇其中表達(dá)效率相對較高的單染色體插入轉(zhuǎn)基因株系,可作為基因編輯的Cas9表達(dá)背景材料,進(jìn)行高通量基因編輯材料庫創(chuàng)建和基因功能研究。為了建立高效的玉米轉(zhuǎn)基因體系,本研究設(shè)計(jì)了一套用于高通量玉米莖尖轉(zhuǎn)化的輔助器材,并初步進(jìn)行了測試。主要結(jié)果如下:(1)玉米基因編輯表達(dá)載體構(gòu)建利用本實(shí)驗(yàn)室提供的帶有2×35S強(qiáng)啟動子和Bar基因篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pSCZ3為骨架,從水稻基因編輯載體pP1C.1中克隆Cas9基因,將之通過酶切連接的方法插入到pSCZ3載體骨架上,成功構(gòu)建了適于玉米轉(zhuǎn)基因高通量篩選的雙元表達(dá)載體pSCZ3-Cas9。(2)玉米...

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因編輯技術(shù)
        1.1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)
        1.1.2 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷史
        1.1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要類型
        1.1.4 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的作用原理
        1.1.5 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的構(gòu)建及在植物中的研究進(jìn)展
        1.1.6 Cas9 基因表達(dá)效率研究現(xiàn)狀
    1.2 玉米轉(zhuǎn)化方法
        1.2.1 玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法
        1.2.2 玉米轉(zhuǎn)化的體系
    1.3 本研究的目的意義
第二章 基因編輯基因Cas9 背景表達(dá)玉米株系的篩選培育
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植株材料
        2.1.2 菌種及載體
        2.1.3 化學(xué)試劑及培養(yǎng)基的配置
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 PCR 引物設(shè)計(jì)
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Cas9 蛋白基因表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.3 Cas9 基因檢測
        2.2.4 Cas9 相對表達(dá)量的檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Cas9 蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 第一批轉(zhuǎn)化植株檢測結(jié)果
        2.3.3 第二批轉(zhuǎn)化植株檢測結(jié)果
        2.3.4 單染色體插入轉(zhuǎn)基因植株Cas9 相對表達(dá)量檢測
    2.4 結(jié)論
第三章 玉米莖尖高通量轉(zhuǎn)化輔助器材的設(shè)計(jì)與初步測試
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 輔助器材所需材料
        3.1.2 植物材料
        3.1.3 菌種及載體
        3.1.4 儀器設(shè)備
        3.1.5 培養(yǎng)基的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 植株幼苗的培養(yǎng)
        3.2.2 工程菌的制備
        3.2.3 玉米生長點(diǎn)的損傷與遺傳轉(zhuǎn)化
    3.3 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果與比較
        3.3.1 幼苗培養(yǎng)方面
        3.3.2 植株幼苗生長點(diǎn)剝露效率
        3.3.3 移栽效率
        3.3.4 對植株的損傷程度
    3.4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3815758