植物中存在Piezo基因,而且與動物中該基因同源性較高,推測其編碼蛋白的功能也應(yīng)與壓力有關(guān),但是目前該基因在植物上的功能尚無任何報道。因此,本文利用TRIzol法提取番茄幼嫩果實(shí)的總RNA,PCR擴(kuò)增番茄Piezo基因片段,利用在線工具尋找靶點(diǎn),通過Overlapping PCR技術(shù)以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ質(zhì)粒為模板構(gòu)建完整的sgRNA表達(dá)盒片段,采用“金門”克隆法將sgRNA表達(dá)盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N表達(dá)載體上,構(gòu)建Piezo基因敲除載體,并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,旨在探討Piezo基因在植物上的功能。番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是一類世界性分布的植物病毒,西紅柿是其主要寄主,侵染西紅柿后使栽培面積大幅下降造成農(nóng)業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失。最近研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a系統(tǒng)是一種能夠靶向和切割基因組單鏈RNA(ssRNA)分子的2類VI-A型核糖核酸酶,可被開發(fā)利用到抗植物RNA病毒研究中。本研究根據(jù)西紅柿密碼子偏好性合成高GC含量的Cas13a,以PYLCRISPR/CAS9Pubi-N質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Pubi啟動子和...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 基因組編輯技術(shù)
        1.1.1 基因組編輯技術(shù)概述
        1.1.2 基因組編輯技術(shù)發(fā)展歷程
        1.1.3 CRISPR/Cas與ZFN、TALEN比較
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)
        1.2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)技術(shù)原理
    1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
        1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中應(yīng)用
            1.3.1.1 NHEJ介導(dǎo)的基因編輯
            1.3.1.2 HDR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)插入或替換
        1.3.2 CRISPR/Cas13a系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
            1.3.2.1 Cas13a與Cas9、Cpf1比較
            1.3.2.2 Cas13a與RNAi比較
    1.4 研究意義及主要研究內(nèi)容
    1.5 創(chuàng)新點(diǎn)
    1.6 技術(shù)路線
2 CRISPR/Cas9基因敲除載體構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 載體和引物
        2.1.4 常用培養(yǎng)基及抗生素的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 番茄幼苗葉片總RNA提取
        2.2.2 RT-PCR方法獲取cDNA
        2.2.3 PCR擴(kuò)增目標(biāo)番茄基因片段
        2.2.4 sgRNA的設(shè)計(jì)
        2.2.5 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建
            2.2.5.1 PYLCRISPR/CAS9Pubi-N、pYLsgRNA-AtU3b/LacZ質(zhì)粒提取
            2.2.5.2 構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒
            2.2.5.3 膠回收
        2.2.6 Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.6.1 Cas9質(zhì)粒酶切
            2.2.6.2 酶切后回收
        2.2.7 CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建
            2.2.7.1 將sgRNA表達(dá)盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N載體
            2.2.7.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
            2.2.7.3 陽性重組質(zhì)粒的篩選
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 番茄幼苗葉片總RNA提取
        2.3.2 番茄Piezo基因片段擴(kuò)增
        2.3.3 載體質(zhì)粒DNA的提取
        2.3.4 基因敲除靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)與合成
        2.3.5 Overlaping PCR構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒
        2.3.6 Cas9表達(dá)載體構(gòu)建
        2.3.7 重組載體質(zhì)粒的提取
        2.3.8 重組質(zhì)粒引物擴(kuò)增鑒定
    2.4 討論
3 西紅柿抗ToMV病毒載體構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 酶、實(shí)驗(yàn)試劑盒
        3.1.3 載體和引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 合成西紅柿密碼子優(yōu)化的的Cas13a
        3.2.2 Cas13a表達(dá)體系構(gòu)建
            3.2.2.1 擴(kuò)增Pubi啟動子
            3.2.2.2 擴(kuò)增Cas13a
            3.2.2.3 擴(kuò)增終止子
            3.2.2.4 Cas13a表達(dá)體系各元件連接
        3.2.3 串聯(lián)crRNA系統(tǒng)
            3.2.3.1 crRNA合成
            3.2.3.2 啟動子的分析與獲取
            3.2.3.3 PCR連接
        3.2.4 合適的植物表達(dá)體系元件
        3.2.5 各種質(zhì)粒元件整合
            3.2.5.1 陽性克隆的鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 Pubi啟動子與Cas13a的擴(kuò)增
        3.3.2 Pubi啟動子與Cas13a連接片段
        3.3.3 擴(kuò)增終止子片段
        3.3.4 構(gòu)建Cas13a表達(dá)體系
        3.3.5 擴(kuò)增U3啟動子與crRNA
        3.3.6 U3啟動子與crRNA片段連接
        3.3.7 擴(kuò)增合適的植物表達(dá)元件
        3.3.8 抗病毒載體質(zhì)粒
    3.4 討論
4 重組載體的轉(zhuǎn)化
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
        4.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        4.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 Piezo基因敲除載體轉(zhuǎn)化
        4.3.2 西紅柿抗ToMV病毒載體轉(zhuǎn)化
    4.4 討論
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
        5.1.1 Piezo基因敲除載體構(gòu)建
        5.1.2 西紅柿抗ToMV病毒載體構(gòu)建
        5.1.3 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 文中所用引物
    附錄2 主要儀器
    附錄3 文中涉及的DNA序列
后記
攻讀學(xué)位期間取得的科研成果清單



本文編號：3814646