化學精煉植物油的目的是為了除去會對成品油的質(zhì)量和保質(zhì)期造成不良影響的雜質(zhì)。然而,考慮到對環(huán)境的影響和經(jīng)濟效益,物理精煉方法的使用正在增加。酶促脫膠則是一種能夠達到物理精煉油要求的脫膠方法,但磷脂酶的生產(chǎn)高成本和低效率局限了其應用。同時,用于脫膠的磷脂酶不能被回收和再次利用也大大提高了酶法脫膠的工業(yè)化應用成本。本研究克隆外膜磷脂酶A1基因,構建原核和真核表達載體,實現(xiàn)其在原核和真核表達體系中的異源表達,研究了其酶學特性與固定化過程,并將其應用于粗菜籽油的酶法脫膠中,為開發(fā)新型磷脂酶和改進脫膠技術提出了一種有效可行的方法,主要結果如下:(1)外膜磷脂酶A1基因克隆及生物信息學分析。將粘質(zhì)沙雷氏菌總基因組當模板,PCR擴增得到目的基因,構建pEASY-OM-PLA1,轉入E.coil DH5α,抽取質(zhì)粒測序驗證并分析。該基因與Serratia marcescens subsp.marcescens Db11同源性為99.55%。進化樹結果顯示,該基因所產(chǎn)OM-PLA1與來源于大腸桿菌NC₀00913.3的OM-PLA1表現(xiàn)出最高的同源性。該蛋白分子式為C_151...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 磷脂酶概述
        1.1.1 磷脂酶簡介
        1.1.2 磷脂酶A1 簡介
    1.2 外膜磷脂酶A簡介
        1.2.1 外膜磷脂酶A的結構
        1.2.2 外膜磷脂酶A的催化機制
        1.2.3 外膜磷脂酶A的激活機制
    1.3 微生物磷脂酶分子生物學研究
    1.4 磷脂酶的修飾
        1.4.1 磷脂酶的化學修飾
        1.4.2 磷脂酶的固定化
    1.5 本課題的研究背景、意義及主要內(nèi)容
        1.5.1 研究背景
        1.5.2 研究意義及目的
        1.5.3 主要內(nèi)容
        1.5.4 項目資助
        1.5.5 主要技術路線框架圖
第二章 外膜磷脂酶A1(OM-PLA1)基因克隆及原核表達
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 質(zhì)粒與菌株
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 溶液的配制
        2.2.2 粘質(zhì)沙雷氏菌總基因組的提取
        2.2.3 外膜磷脂酶A1 基因的PCR擴增及回收
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的連接與轉化
        2.2.5 質(zhì)粒提取及測序鑒定
        2.2.6 外膜磷脂酶A1 基因生物學信息分析
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉化BL21
        2.2.8 原核誘導表達重組外膜磷脂酶A1
        2.2.9 重組外膜磷脂酶A1 酶活力測定
        2.2.10 粗酶液純化及SDS-PAGE鑒定
        2.2.11 外膜磷脂酶A1 原核表達條件優(yōu)化
        2.2.12 重組外膜磷脂酶A1 的酶學特性研究
        2.2.13 重組外膜磷脂酶A1 的菜籽油脫膠應用
    2.3 結果與分析
        2.3.1 目的基因的擴增
        2.3.2 菌落PCR鑒定
        2.3.3 測序鑒定
        2.3.4 蛋白進化樹的構建
        2.3.5 生物學信息分析
        2.3.6 重組蛋白的純化及SDS-PAGE鑒定
        2.3.7 重組外膜磷脂酶A1 誘導表達優(yōu)化
        2.3.8 重組外膜磷脂酶A1 酶學特性研究
        2.3.9 酶法脫膠條件優(yōu)化
    2.4 本章小結
第三章 外膜磷脂酶A1(OM-PLA1)基因在畢赤酵母中的表達、固定化及菜籽油脫膠
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 所用試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 溶液的配制
        3.2.2 表達載體的構建
        3.2.3 表達載體轉化P.pastoris GS115
        3.2.4 轉化子表型篩選
        3.2.5 重組畢赤酵母的鑒定
        3.2.6 重組外膜磷脂酶A1 在畢赤酵母中的表達
        3.2.7 重組畢赤酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化
        3.2.8 Fe₃O₄/氧化石墨烯的制備及外膜磷脂酶A1 的固定化
        3.2.9 固定化外膜磷脂酶A1 菜籽油脫膠應用
        3.2.10 固定化外膜磷脂酶A1 酶法脫膠條件優(yōu)化
        3.2.11 固定化外膜磷脂酶A1 的回收和再利用
    3.3 結果與分析
        3.3.1 目的基因PCR擴增及純化回收
        3.3.2 表達載體pPIC9K-His-OM-PLA1 的構建
        3.3.3 重組畢赤酵母的構建與表型篩選
        3.3.4 重組畢赤酵母PCR鑒定
        3.3.5 重組P.pastoris表達外膜磷脂酶A1 的酶活測定
        3.3.6 重組外膜磷脂酶A1 的純化及SDS-PAGE
        3.3.7 重組畢赤酵母發(fā)酵條件優(yōu)化
        3.3.8 Fe₃O₄/氧化石墨烯表征分析
        3.3.9 固定化外膜磷脂酶A1 固定化條件優(yōu)化
        3.3.10 pH和溫度對固定化外膜磷脂酶A1 酶活力的影響
        3.3.11 固定化外膜磷脂酶A1 貯藏穩(wěn)定性研究
        3.3.12 菜籽油脫膠條件優(yōu)化
        3.3.13 固定化外膜磷脂酶A1 的回收和利用
    3.4 討論
    3.5 本章小結
第四章 結論與展望
    4.1 結論
    4.2 展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間的學術活動及成果情況



本文編號：3806869