植物寄生線蟲是危害水稻的重要病原物之一,給水稻產(chǎn)量帶來重大損失。在侵染寄主植物的過程中,線蟲通過分泌細(xì)胞壁降解酶來軟化降解植物細(xì)胞壁協(xié)助侵染,完成寄生。在線蟲分泌的細(xì)胞壁降解酶中,β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶是目前研究最多的一種。β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶能夠水解植物細(xì)胞壁中的1,4糖苷鍵,破壞纖維素的結(jié)構(gòu),最終降解植物細(xì)胞壁。為研究尖細(xì)潛根線蟲(Hirschmanniella mucronata)β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(Hm-eng-1)在侵染過程中的生物學(xué)功能,本實(shí)驗(yàn)的工作內(nèi)容作如下安排:1.尖細(xì)潛根線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析:通過分析侵染抗病水稻RN51的線蟲、侵染感病水稻RN155的線蟲和未侵染任何水稻的線蟲NHP的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),當(dāng)RPKM>0.3時(shí),樣本中約有143000個(gè)基因表達(dá),約82.3%的線蟲基因組編碼基因。其中參與檸檬酸循環(huán)(TCA),糖酵解途徑(EMP)的基因,RNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因,氨基酸合成基因,脂肪酸代謝相關(guān)基因和細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào)。這表明線蟲在侵染水稻時(shí),其代謝水平的提高能夠?yàn)槌晒η秩炯闹魈峁┪镔|(zhì)基礎(chǔ)。2.Hm-eng-1基因的克隆和序列分析:...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 潛根線蟲的概述
        1.1.1 潛根線蟲的生物學(xué)特性
        1.1.2 潛根線蟲及其危害
    1.2 植物寄生線蟲效應(yīng)子在線蟲寄生過程中的重要作用
        1.2.1 降解或修飾植物細(xì)胞壁
        1.2.2 調(diào)節(jié)植物免疫防御
        1.2.3 調(diào)控植物細(xì)胞發(fā)育
    1.3 植物寄生線蟲效應(yīng)子的定位研究
        1.3.1 食道腺細(xì)胞
        1.3.2 頭感器
        1.3.3 皮下組織
        1.3.4 其他
    1.4 線蟲β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶的研究進(jìn)展
        1.4.1 eng及其序列特征
        1.4.2 β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶的蛋白序列特征
        1.4.3 eng基因表達(dá)分析
    1.5 本研究的目的及內(nèi)容
        1.5.1 課題來源
        1.5.2 研究目的
        1.5.3 研究內(nèi)容
        1.5.4 研究技術(shù)路線
第二章 尖細(xì)潛根線蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
    2.2 方法
        2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
        2.2.2 參考序列(ref)比對
        2.2.3 基因表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析
        2.2.4 差異表達(dá)基因(DEG)的分析
        2.2.5 差異基因GO富集分析
        2.2.6 差異基因KEGG富集分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量結(jié)果
        2.3.2 ref比對結(jié)果
        2.3.3 基因表達(dá)水平
        2.3.4 DEGs統(tǒng)計(jì)
        2.3.5 差異基因GO富集分析
        2.3.6 差異基因KEGG富集分析
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 尖細(xì)潛根線蟲Hm-eng-1基因的克隆與序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 載體及菌株
        3.1.2 引物
    3.2 方法
        3.2.1 潛根線蟲的收集
        3.2.2 潛根線蟲總RNA的提取
        3.2.3 cDNA第一條鏈的合成
        3.2.4 Hm-eng-1基因cDNA全長的擴(kuò)增
            3.2.4.1 第一次PCR
            3.2.4.2 第二次PCR
        3.2.5 克隆測序
            3.2.5.1 PCR產(chǎn)物回收純化
            3.2.5.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.5.3 單菌落PCR篩選陽性克隆
            3.2.5.4 測序與保種
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 RNA提取結(jié)果
        3.3.2 Hm-eng-1基因的擴(kuò)增
        3.3.3 Hm-eng-1基因克隆載體陽性鑒定
        3.3.4 Hm-eng-1基因的序列分析
        3.3.5 ENG蛋白的系譜分析
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 尖細(xì)潛根線蟲Hm-eng-1基因的表達(dá)定位研究
    4.1 材料
        4.1.1 引物
    4.2 方法
        4.2.1 潛根線蟲的收集
        4.2.2 探針合成
            4.2.2.1 重組質(zhì)粒的提取
            4.2.2.2 第一輪PCR
            4.2.2.3 PCR產(chǎn)物回收純化
            4.2.2.4 第二輪PCR
        4.2.3 原位雜交
            4.2.3.1 線蟲的固定
            4.2.3.2 雜交前處理
            4.2.3.3 預(yù)雜交、雜交
            4.2.3.4 雜交后處理
            4.2.3.5 顯色與觀察
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 探針合成
        4.3.2 原位雜交結(jié)果
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 尖細(xì)潛根線蟲Hm-eng-1基因的原核表達(dá)
    5.1 材料
        5.1.1 載體及菌株
        5.1.2 引物
    5.2 方法
        5.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
            5.2.1.1 提取重組質(zhì)粒
            5.2.1.2 Hm-eng-1基因的PCR擴(kuò)增
            5.2.1.3 PCR產(chǎn)物回收純化
            5.2.1.4 目的片段與原核表達(dá)載體連接與轉(zhuǎn)化
            5.2.1.5 單菌落PCR篩選陽性克隆
            5.2.1.6 測序與保種
        5.2.2 Hm-eng-1基因的表達(dá)
            5.2.2.1 提取重組表達(dá)載體質(zhì)粒
            5.2.2.2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            5.2.2.3 Hm-eng-1基因的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.2.3 SDS-PAGE蛋白電泳
            5.2.3.1 制膠
            5.2.3.2 上樣
            5.2.3.3 電泳
            5.2.3.4 染色、脫色
            5.2.3.5 檢測
        5.2.4 重組蛋白的Westernblot
            5.2.4.1 SDS-PAGE電泳
            5.2.4.2 轉(zhuǎn)膜
            5.2.4.3 封閉
            5.2.4.4 抗體孵育
            5.2.4.5 發(fā)光液顯色
            5.2.4.6 檢測與保存
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建pEASY-BluntE1-Hm-eng-1的構(gòu)建
        5.3.2 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
    5.4 結(jié)論與討論
第六章 RNAi技術(shù)分析尖細(xì)潛根線蟲Hm-eng-1基因功能
    6.1 材料
        6.1.1 載體及菌株
        6.1.2 引物
    6.2 方法
        6.2.1 入門載體的構(gòu)建
            6.2.1.1 提取重組質(zhì)粒、pGWC入門載體質(zhì)粒
            6.2.1.2 Hm-eng-1基因的PCR擴(kuò)增
            6.2.1.3 pGWC入門載體的酶切
            6.2.1.4 PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物回收純化
            6.2.1.5 目的片段與入門載體連接與轉(zhuǎn)化
            6.2.1.6 單菌落PCR篩選陽性克隆
            6.2.1.7 測序與保種
        6.2.2 RNAi載體的構(gòu)建
            6.2.2.1 提取pB7G干擾載體質(zhì)粒
            6.2.2.2 LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi載體
            6.2.2.3 單菌落PCR篩選陽性克隆
            6.2.2.4 測序與保種
        6.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染水稻
            6.2.3.1 制備感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101
            6.2.3.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及陽性轉(zhuǎn)化檢測
            6.2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染水稻
            6.2.3.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定
    6.3 結(jié)果分析
        6.3.1 RNAi載體的構(gòu)建
        6.3.2 重組干擾載體pB7G-Hm-eng-1轉(zhuǎn)化GV3101
        6.3.3 PCR法檢測轉(zhuǎn)基因水稻植株
        6.3.4 快速試紙條法檢測轉(zhuǎn)基因水稻植株
    6.4 結(jié)論與討論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3795670