肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN),又名抑肌素、生長分化因子8(GDF-8),屬于TGF-β超家族,其功能主要是作為一種骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子,限制肌肉超常發(fā)育。該基因的缺失或突變會(huì)使肌細(xì)胞增生和肥大,機(jī)體表現(xiàn)為雙肌性狀。近年來,研究發(fā)現(xiàn)MSTN不僅可調(diào)控肌肉生長發(fā)育,在肌肉穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用,而且還影響脂肪形成和骨骼發(fā)育,并與胰島素敏感性有關(guān)。對MSTN基因的深入研究在畜牧業(yè)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。因此,有關(guān)MSTN基因與多種疾病的關(guān)系及其在機(jī)體代謝中的作用受到廣泛關(guān)注。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。該技術(shù)可以簡便、快速、高效、特異性的抑制基因的表達(dá),因此受到了各個(gè)領(lǐng)域研究人員的重視。本文擬構(gòu)建靶向MSTN基因的pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體,并使用不同的體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染小鼠并比較其體內(nèi)干擾效果,為后續(xù)開展相應(yīng)的MSTN基因功能研究奠定工作基礎(chǔ)。本文首先根據(jù)MSTN基因的mRNA序列設(shè)計(jì)siRNA,并挑選出3條可能具有良好干擾效果的siRNA...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 肌肉生長抑制素概述
        1.1.1 肌肉生長抑制素的結(jié)構(gòu)及分布
        1.1.2 肌肉生長抑制素的作用機(jī)制
        1.1.3 肌肉生長抑制素研究進(jìn)展
    1.2 RNA干擾
    1.3 基因載體
        1.3.1 基因治療載體概述
        1.3.2 陽離子聚合物PEI
        1.3.3 脂質(zhì)體
    1.4 本課題的研究目的及意義
第二章 MSTN基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與初步篩選
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 MSTN shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成
        2.2.2 pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 重組干擾質(zhì)粒的提取
        2.2.4 shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi)
        2.2.5 熒光定量PCR
        2.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 pSIREN-DNR-DsRed-Express載體的酶切
        2.3.2 pSIREN-MSTN-shRNA表達(dá)載體的鑒定
        2.3.3 質(zhì)粒提取質(zhì)量鑒定
        2.3.4 shRNA干擾后MSTN的 mRNA表達(dá)水平檢測
        2.3.5 Western blot檢測干擾后MSTN的蛋白質(zhì)表達(dá)
    2.4 討論
第三章 肌肉注射法介導(dǎo)的小鼠體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質(zhì)粒的大量提取及純化
        3.2.2 小鼠肌肉注射
        3.2.3 免疫印跡分析(Western blot,WB)
        3.2.4 肌肉組織HE染色
        3.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 質(zhì)粒提取結(jié)果
        3.3.2 干擾后小鼠的體重結(jié)果
        3.3.3 Western blot檢測MSTN的蛋白質(zhì)表達(dá)
        3.3.4 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    3.4 討論
第四章 PEI/shRNA復(fù)合物介導(dǎo)的小鼠體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質(zhì)粒的大量提取及純化
        4.2.2 PEI/質(zhì)粒DNA復(fù)合物的形成
        4.2.3 PEI/pSIREN-MSTN體內(nèi)轉(zhuǎn)染
        4.2.4 Western印跡
        4.2.5 肌肉組織切片及HE染色
        4.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 質(zhì)粒濃度與純度測定
        4.3.2 干擾后小鼠的體重結(jié)果
        4.3.3 Western blot檢測MSTN的蛋白質(zhì)表達(dá)
        4.3.4 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    4.4 討論
第五章 卵磷脂-膽固醇脂質(zhì)體介導(dǎo)的小鼠體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質(zhì)粒的大量提取及純化
        5.2.2 卵磷脂-膽固醇脂質(zhì)體的制備
        5.2.3 脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒pSIREN-MSTN體內(nèi)轉(zhuǎn)染
        5.2.4 Western印跡
        5.2.5 肌肉組織切片及HE染色
        5.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 干擾后小鼠的體重結(jié)果
        5.3.2 Western blot檢測MSTN的蛋白質(zhì)表達(dá)
        5.3.3 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    5.4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄1 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備
附錄2 主要試劑配方
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3795260