肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN),又名抑肌素、生長分化因子8(GDF-8),屬于TGF-β超家族,其功能主要是作為一種骨骼肌生長的負調控因子,限制肌肉超常發(fā)育。該基因的缺失或突變會使肌細胞增生和肥大,機體表現(xiàn)為雙肌性狀。近年來,研究發(fā)現(xiàn)MSTN不僅可調控肌肉生長發(fā)育,在肌肉穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用,而且還影響脂肪形成和骨骼發(fā)育,并與胰島素敏感性有關。對MSTN基因的深入研究在畜牧業(yè)及醫(yī)學領域具有重要意義。因此,有關MSTN基因與多種疾病的關系及其在機體代謝中的作用受到廣泛關注。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。該技術可以簡便、快速、高效、特異性的抑制基因的表達,因此受到了各個領域研究人員的重視。本文擬構建靶向MSTN基因的pSIREN-MSTN-shRNA表達載體,并使用不同的體內轉染方法轉染小鼠并比較其體內干擾效果,為后續(xù)開展相應的MSTN基因功能研究奠定工作基礎。本文首先根據MSTN基因的mRNA序列設計siRNA,并挑選出3條可能具有良好干擾效果的siRNA...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 肌肉生長抑制素概述
        1.1.1 肌肉生長抑制素的結構及分布
        1.1.2 肌肉生長抑制素的作用機制
        1.1.3 肌肉生長抑制素研究進展
    1.2 RNA干擾
    1.3 基因載體
        1.3.1 基因治療載體概述
        1.3.2 陽離子聚合物PEI
        1.3.3 脂質體
    1.4 本課題的研究目的及意義
第二章 MSTN基因shRNA表達載體的構建與初步篩選
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 MSTN shRNA序列的設計與合成
        2.2.2 pSIREN-MSTN-shRNA表達載體的構建
        2.2.3 重組干擾質粒的提取
        2.2.4 shRNA表達載體導入小鼠體內
        2.2.5 熒光定量PCR
        2.2.6 Western blot實驗
        2.2.7 統(tǒng)計學分析
    2.3 結果
        2.3.1 pSIREN-DNR-DsRed-Express載體的酶切
        2.3.2 pSIREN-MSTN-shRNA表達載體的鑒定
        2.3.3 質粒提取質量鑒定
        2.3.4 shRNA干擾后MSTN的 mRNA表達水平檢測
        2.3.5 Western blot檢測干擾后MSTN的蛋白質表達
    2.4 討論
第三章 肌肉注射法介導的小鼠體內干擾實驗
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 實驗試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質粒的大量提取及純化
        3.2.2 小鼠肌肉注射
        3.2.3 免疫印跡分析(Western blot,WB)
        3.2.4 肌肉組織HE染色
        3.2.5 統(tǒng)計學分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 質粒提取結果
        3.3.2 干擾后小鼠的體重結果
        3.3.3 Western blot檢測MSTN的蛋白質表達
        3.3.4 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    3.4 討論
第四章 PEI/shRNA復合物介導的小鼠體內干擾實驗研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質粒的大量提取及純化
        4.2.2 PEI/質粒DNA復合物的形成
        4.2.3 PEI/pSIREN-MSTN體內轉染
        4.2.4 Western印跡
        4.2.5 肌肉組織切片及HE染色
        4.2.6 統(tǒng)計學分析
    4.3 實驗結果
        4.3.1 質粒濃度與純度測定
        4.3.2 干擾后小鼠的體重結果
        4.3.3 Western blot檢測MSTN的蛋白質表達
        4.3.4 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    4.4 討論
第五章 卵磷脂-膽固醇脂質體介導的小鼠體內干擾實驗
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物
        5.1.2 實驗試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 pSIREN-MSTN重組干擾質粒的大量提取及純化
        5.2.2 卵磷脂-膽固醇脂質體的制備
        5.2.3 脂質體包裹的質粒pSIREN-MSTN體內轉染
        5.2.4 Western印跡
        5.2.5 肌肉組織切片及HE染色
        5.2.6 統(tǒng)計學分析
    5.3 實驗結果
        5.3.1 干擾后小鼠的體重結果
        5.3.2 Western blot檢測MSTN的蛋白質表達
        5.3.3 HE染色檢測肌纖維狀態(tài)
    5.4 討論
參考文獻
附錄1 實驗主要儀器設備
附錄2 主要試劑配方
攻讀碩士學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式



本文編號：3795260