細(xì)菌人工染色體文庫是生物基因組研究的重要資源,它們被成功地應(yīng)用于圖位克隆,構(gòu)建物理圖譜以及全基因組測(cè)序。本研究工作由兩部分組成:1.放線菌BAC載體改造及放線菌0026 BAC文庫構(gòu)建;2.矮牽牛BAC文庫構(gòu)建及相關(guān)基因篩選。放線菌(Actinomycetes)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥和學(xué)術(shù)研究上有著重要意義。常用于構(gòu)建放線菌BAC(Bacterial artificial chromosome)文庫的載體為pMSBBACs,用其構(gòu)建的放線菌BAC文庫在進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)時(shí)存在一定的缺陷。本研究通過在放線菌復(fù)合載體pMSBBACs中引入歸位內(nèi)切酶I-SceI位點(diǎn),改造出適用于放線菌屬大片段基因組DNA克隆和異源表達(dá)的pHZAUBACFXJ1復(fù)合載體。pHZAUBACFXJ1載體不僅在構(gòu)建放線菌文庫方面簡(jiǎn)單實(shí)用,在驗(yàn)證文庫質(zhì)量時(shí)用I-Sce I代替NotI進(jìn)行酶切,也方便放線菌BAC文庫外源插入片段大小的計(jì)算,評(píng)估放線菌BAC文庫質(zhì)量。本研究使用pHZAUBACFXJ1復(fù)合載體成功構(gòu)建了一個(gè)放線菌0026的BAC文庫。該文庫總計(jì)3,456個(gè)克隆,保存在9塊384板中,隨機(jī)挑揀40個(gè)放線菌BAC...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 克隆載體的發(fā)展
    1.3 BAC載體的發(fā)展
        1.3.1 pBAC108L克隆載體
        1.3.2 pCUGIBAC1克隆載體
        1.3.3 pHZAUBAC1克隆載體
        1.3.4 pMSBBACs克隆載體
    1.4 BAC文庫簡(jiǎn)介與應(yīng)用
    1.5 研究目的
2 材料與方法
    2.1 材料
    2.2 主要試劑及配制方法
    2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 放線菌BAC載體改造及放線菌0026 BAC文庫構(gòu)建
            2.4.1.1 放線菌pHZAUBACFXJ1載體改造
            2.4.1.2 pHZAUBACFXJ1 BAC載體制備
            2.4.1.3 放線菌0026基因組DNA plug的制備
            2.4.1.4 放線菌0026基因組DNA plug的預(yù)電泳
            2.4.1.5 放線菌0026基因組DNA的預(yù)先部分酶切
            2.4.1.6 放線菌0026大片段DNA的2次篩選
            2.4.1.7 連接、脫鹽、預(yù)轉(zhuǎn)化與檢測(cè)
            2.4.1.8 放線菌文庫質(zhì)量的檢測(cè)
            2.4.1.9 放線菌BAC文庫的復(fù)制和混合池構(gòu)建
        2.4.2 矮牽牛BAC文庫構(gòu)建及相關(guān)基因篩選
            2.4.2.1 BAC載體pIndigoBAC536-S制備
            2.4.2.2 HMW矮牽牛大片段基因組DNA的制備
            2.4.2.3 尋找矮牽�；蚪MDNA部分酶切的最適合條件
            2.4.2.4 合適大小的矮牽�；蚪MDNA的獲得
            2.4.2.5 矮牽�；蚪MDNA的連接
            2.4.2.6 脫鹽、預(yù)轉(zhuǎn)化、插入片段大小檢測(cè)
            2.4.2.7 大量轉(zhuǎn)化、挑揀單克隆
            2.4.2.8 矮牽牛BAC文庫的鑒定
            2.4.2.9 矮牽牛BAC文庫的復(fù)制
            2.4.2.10 矮牽牛BAC文庫的基因篩選
3 結(jié)果與分析
    3.1 放線菌BAC載體改造及放線菌0026BAC文庫構(gòu)建
        3.1.1 放線菌pHZAUBACFXJ1載體的改造
        3.1.2 放線菌pHZAUBACFXJ1-s質(zhì)粒載體的制備
        3.1.3 放線菌0026基因組DNAplug的制備
        3.1.4 放線菌0026基因組DNA的預(yù)電泳與部分酶切
        3.1.5 放線菌0026大片段DNA的兩次篩選
        3.1.6 大片段DNA的電洗脫回收與檢測(cè)
        3.1.7 放線菌大片段DNA的連接、脫鹽與預(yù)轉(zhuǎn)化
    3.2 矮牽牛BAC文庫構(gòu)建及相關(guān)基因篩選
        3.2.1 HMW矮牽牛大片段基因組DNA的制備
        3.2.2 尋找矮牽�；蚪MDNA部分酶切的最適合條件
        3.2.3 合適大小的矮牽�；蚪MDNA的獲得
        3.2.4 脫鹽、預(yù)轉(zhuǎn)化、插入片段大小檢測(cè)
        3.2.5 大量轉(zhuǎn)化、挑揀單克隆
        3.2.6 矮牽牛BAC文庫的鑒定
        3.2.7 矮牽牛BAC文庫基因篩選
            3.2.7.1 一級(jí)混合池構(gòu)建與PCR篩選
            3.2.7.2 二級(jí)混合池構(gòu)建與PCR篩選
4 討論
    4.1 關(guān)于高質(zhì)量的大片段外源DNA的獲取
    4.2 關(guān)于放線菌BAC載體的改造
    4.3 關(guān)于放線菌BAC文庫的構(gòu)建
    4.4 關(guān)于矮牽牛重瓣花BAC文庫的構(gòu)建
    4.5 關(guān)于矮牽牛BAC文庫基因篩選
參考文獻(xiàn)
附錄 A 實(shí)驗(yàn)部分試劑配方
附錄 B BAC質(zhì)粒提取步驟
附錄 C 基因篩選引物信息
致謝



本文編號(hào)：3775552