目的從川續(xù)斷Dipsacus asper中克隆并篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因用于實時熒光PCR(qRT-PCR)的分析校正,為今后川續(xù)斷功能基因的表達(dá)分析及調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。方法從川續(xù)斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選并克隆肌動蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)、GAPDH基因家族內(nèi)參基因的核心片段,以不同產(chǎn)地、不同組織部位和不同發(fā)育時期的川續(xù)斷植株為材料,通過qRT-PCR獲得各基因的表達(dá)信息,利用ge Norm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT、RefFinder共5個內(nèi)參評價軟件分析各基因的表達(dá)穩(wěn)定性,綜合評價并篩選出最佳的川續(xù)斷內(nèi)參基因。結(jié)果克隆獲得10個候選內(nèi)參基因核心片段,分別屬于Actin、Tubulin、GAPDH3大基因家族,各家族基因序列間同源性較高;穩(wěn)定性綜合分析結(jié)果顯示,DaACT103在不同產(chǎn)地及不同組織部位的表達(dá)穩(wěn)定性較強(qiáng)且表達(dá)量相對較高,Da TUB5在不同發(fā)育時期的表達(dá)穩(wěn)定性較強(qiáng)且表達(dá)量相對較低。結(jié)論 Da ACT103和Da TUB5均可作為川續(xù)斷的內(nèi)參基因,其中,Da ACT103適用于作為具有較高表達(dá)豐度基因的內(nèi)參基因;Da ...

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【文章目錄】：
1 材料及儀器試劑
    1.1 材料
    1.2 儀器及試劑
2 方法
    2.1 總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄
    2.2 候選基因的獲得與PCR擴(kuò)增
    2.3 切膠回收、TA克隆及序列分析
    2.4 q RT-PCR
    2.5 穩(wěn)定性分析
    2.6 引物特異性及擴(kuò)增效率
3 結(jié)果與分析
    3.1 總RNA質(zhì)量檢測與PCR擴(kuò)增
    3.2 序列同源性及進(jìn)化樹分析
    3.3 表達(dá)穩(wěn)定性分析
        3.3.1 不同產(chǎn)地川續(xù)斷候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析
        3.3.2 不同組織部位川續(xù)斷候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析
        3.3.3 不同發(fā)育時期川續(xù)斷候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析
    3.4 引物擴(kuò)增效率
4 討論



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