本課題組前期從油污土壤中分離到一株脂肪酶高產(chǎn)菌株,經(jīng)分子鑒定并命名為Burkholderia sp.ZYB002;克隆了脂肪酶編碼基因lipA及其對應伴侶蛋白編碼基因lipB;構(gòu)建了重組表達菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-lipA/lipB,實現(xiàn)了脂肪酶基因lipA的異源可溶性表達,但可溶性表達水平較低。為了進一步提高脂肪酶基因lipA在大腸桿菌中的可溶性表達水平,本研究對脂肪酶基因lipA的表達體系進行了一系列優(yōu)化,篩選出合適的宿主菌、表達載體;并對其發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,顯著提高了lipA基因在E.coli體內(nèi)的可溶性表達水平;分析純化了該重組蛋白,并對其基本酶學性質(zhì)進行了表征。具體實驗結(jié)果如下:1.脂肪酶基因lipA表達體系的優(yōu)化。lipA與lipB分別插入到不同表達載體上或同一表達載體的不同多克隆位點,組成共表達體系。發(fā)現(xiàn)pETDuet載體,且lipB插入到MCS1處、lipA插入到MCS2處形成的共表達體系最有利于lipA的可溶性共表達;E.coli Origami 2(DE3)菌株較,E.coli BL21(DE3)菌株lipA的可溶性表達水平高。2...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
中文文摘
緒論
    1 脂肪酶概述
        1.1 脂肪酶來源
        1.2 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶研究現(xiàn)狀及應用
    2 蛋白質(zhì)異源表達系統(tǒng)簡介
        2.1 原核生物蛋白異源表達系統(tǒng)
        2.2 真核生物蛋白異源表達系統(tǒng)
    3 提高目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的策略
        3.1 降低目的蛋白合成速度
        3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基組分
        3.3 融合表達
        3.4 篩選可溶性突變體
        3.5 篩選使用合適的大腸桿菌表達宿主菌
        3.6 共表達非特異性分子伴侶
        3.7 共表達特異性天然伴侶折疊酶
    4 本課題的研究背景及意義、內(nèi)容、技術(shù)路線
        4.1 本課題的研究背景及意義
        4.2 本課題的研究內(nèi)容
        4.3 本課題的研究技術(shù)路線
第一章 Burkholderia sp.脂肪酶編碼基因lipA及其對應伴侶蛋白編碼基因lipB共表達載體的構(gòu)建
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗菌株及質(zhì)粒
        2.2 實驗引物
        2.3 實驗試劑與酶
        2.4 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.5 實驗設備
    3 實驗方法
        3.1 E.coli DH5α感受態(tài)細胞的制備
        3.2 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侶蛋白基因克隆
        3.3 質(zhì)粒pETDuet-lipB²的構(gòu)建
        3.4 質(zhì)粒pETDuet-lipA/lipB的構(gòu)建
        3.5 質(zhì)粒pET28a-lipA的構(gòu)建
        3.6 質(zhì)粒pET28a-lipB的構(gòu)建
        3.7 質(zhì)粒pACYCDuet-lipA¹的構(gòu)建
        3.8 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB¹和pETDuet-liB¹的構(gòu)建
        3.9 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的構(gòu)建
    4 結(jié)果和分析
        4.1 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侶蛋白基因的克隆
        4.2 質(zhì)粒pETDuet-lipB²的構(gòu)建
        4.3 質(zhì)粒pETDuet-lipA/lipB的構(gòu)建
        4.4 質(zhì)粒pET28a-lipA的構(gòu)建
        4.5 質(zhì)粒pET28a-lipB的構(gòu)建
        4.6 質(zhì)粒pACYCDuet-lipA¹的構(gòu)建
        4.7 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB¹和pETDuet-lipB¹的構(gòu)建
        4.8 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的構(gòu)建
    5 小結(jié)與討論
第二章 lipA/lipB共表達體系的篩選及其優(yōu)化
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗菌株
        2.2 實驗試劑
        2.3 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.4 實驗設備
    3 實驗方法
        3.1 不同重組質(zhì)粒組合分別共轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)和E. coli Origami 2(DE3)
        3.2 脂肪酶LipA的誘導表達
        3.3 菌體密度OD₆₀₀值測定
        3.4 脂肪酶LipA的酶活力測定
        3.5 SDS-PAGE分析
        3.6 不同重組表達菌株分別在20℃條件下的生長曲線的測定
        3.7 誘導劑IPTG作用濃度的優(yōu)化
    4 結(jié)果和分析
        4.1 各重組表達菌株分別在30℃和20℃發(fā)酵條件下的可溶性表達水平
        4.2 SDS-PAGE分析
        4.3 不同重組表達菌株分別在20℃條件下的生長曲線的測定
        4.4 誘導劑IPTG作用濃度的優(yōu)化
    5 小結(jié)與討論
第三章 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶LipA的分離純化及其酶學性質(zhì)分析
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗菌株及質(zhì)粒
        2.2 實驗試劑
        2.3 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.4 實驗設備
    3 實驗方法
        3.1 脂肪酶LipA的誘導表達
        3.2 脂肪酶LipA的分離純化
        3.3 純化后的脂肪酶LipA酶活力測定
        3.4 純化后的脂肪酶LipA蛋白含量的測定
        3.5 純化后的重組脂肪酶LipA的酶學性質(zhì)分析
    4 結(jié)果和分析
        4.1 重組脂肪酶LipA的純化
        4.2 重組脂肪酶LipA的酶學性質(zhì)分析
    5 小結(jié)與討論
第四章 結(jié)論與后續(xù)工作
    1 結(jié)論
    2 后續(xù)工作
附錄
參考文獻
攻讀學位期間承擔的科研任務與主要成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3763050