本課題組前期從油污土壤中分離到一株脂肪酶高產(chǎn)菌株,經(jīng)分子鑒定并命名為Burkholderia sp.ZYB002;克隆了脂肪酶編碼基因lipA及其對(duì)應(yīng)伴侶蛋白編碼基因lipB;構(gòu)建了重組表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-lipA/lipB,實(shí)現(xiàn)了脂肪酶基因lipA的異源可溶性表達(dá),但可溶性表達(dá)水平較低。為了進(jìn)一步提高脂肪酶基因lipA在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平,本研究對(duì)脂肪酶基因lipA的表達(dá)體系進(jìn)行了一系列優(yōu)化,篩選出合適的宿主菌、表達(dá)載體;并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,顯著提高了lipA基因在E.coli體內(nèi)的可溶性表達(dá)水平;分析純化了該重組蛋白,并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.脂肪酶基因lipA表達(dá)體系的優(yōu)化。lipA與lipB分別插入到不同表達(dá)載體上或同一表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn),組成共表達(dá)體系。發(fā)現(xiàn)pETDuet載體,且lipB插入到MCS1處、lipA插入到MCS2處形成的共表達(dá)體系最有利于lipA的可溶性共表達(dá);E.coli Origami 2(DE3)菌株較,E.coli BL21(DE3)菌株lipA的可溶性表達(dá)水平高。2...

【文章頁(yè)數(shù)】：94 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
緒論
    1 脂肪酶概述
        1.1 脂肪酶來(lái)源
        1.2 洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶研究現(xiàn)狀及應(yīng)用
    2 蛋白質(zhì)異源表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介
        2.1 原核生物蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)
        2.2 真核生物蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)
    3 提高目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的策略
        3.1 降低目的蛋白合成速度
        3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基組分
        3.3 融合表達(dá)
        3.4 篩選可溶性突變體
        3.5 篩選使用合適的大腸桿菌表達(dá)宿主菌
        3.6 共表達(dá)非特異性分子伴侶
        3.7 共表達(dá)特異性天然伴侶折疊酶
    4 本課題的研究背景及意義、內(nèi)容、技術(shù)路線
        4.1 本課題的研究背景及意義
        4.2 本課題的研究?jī)?nèi)容
        4.3 本課題的研究技術(shù)路線
第一章 Burkholderia sp.脂肪酶編碼基因lipA及其對(duì)應(yīng)伴侶蛋白編碼基因lipB共表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒
        2.2 實(shí)驗(yàn)引物
        2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與酶
        2.4 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侶蛋白基因克隆
        3.3 質(zhì)粒pETDuet-lipB²的構(gòu)建
        3.4 質(zhì)粒pETDuet-lipA/lipB的構(gòu)建
        3.5 質(zhì)粒pET28a-lipA的構(gòu)建
        3.6 質(zhì)粒pET28a-lipB的構(gòu)建
        3.7 質(zhì)粒pACYCDuet-lipA¹的構(gòu)建
        3.8 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB¹和pETDuet-liB¹的構(gòu)建
        3.9 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的構(gòu)建
    4 結(jié)果和分析
        4.1 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶基因及其伴侶蛋白基因的克隆
        4.2 質(zhì)粒pETDuet-lipB²的構(gòu)建
        4.3 質(zhì)粒pETDuet-lipA/lipB的構(gòu)建
        4.4 質(zhì)粒pET28a-lipA的構(gòu)建
        4.5 質(zhì)粒pET28a-lipB的構(gòu)建
        4.6 質(zhì)粒pACYCDuet-lipA¹的構(gòu)建
        4.7 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB¹和pETDuet-lipB¹的構(gòu)建
        4.8 質(zhì)粒pACYCDuet-lipB/lipA和pETDuet-lipB/lipA的構(gòu)建
    5 小結(jié)與討論
第二章 lipA/lipB共表達(dá)體系的篩選及其優(yōu)化
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.3 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 不同重組質(zhì)粒組合分別共轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)和E. coli Origami 2(DE3)
        3.2 脂肪酶LipA的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3 菌體密度OD₆₀₀值測(cè)定
        3.4 脂肪酶LipA的酶活力測(cè)定
        3.5 SDS-PAGE分析
        3.6 不同重組表達(dá)菌株分別在20℃條件下的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        3.7 誘導(dǎo)劑IPTG作用濃度的優(yōu)化
    4 結(jié)果和分析
        4.1 各重組表達(dá)菌株分別在30℃和20℃發(fā)酵條件下的可溶性表達(dá)水平
        4.2 SDS-PAGE分析
        4.3 不同重組表達(dá)菌株分別在20℃條件下的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        4.4 誘導(dǎo)劑IPTG作用濃度的優(yōu)化
    5 小結(jié)與討論
第三章 Burkholderia sp. ZYB002脂肪酶LipA的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)分析
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒
        2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.3 培養(yǎng)基及主要溶液的配置
        2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 脂肪酶LipA的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2 脂肪酶LipA的分離純化
        3.3 純化后的脂肪酶LipA酶活力測(cè)定
        3.4 純化后的脂肪酶LipA蛋白含量的測(cè)定
        3.5 純化后的重組脂肪酶LipA的酶學(xué)性質(zhì)分析
    4 結(jié)果和分析
        4.1 重組脂肪酶LipA的純化
        4.2 重組脂肪酶LipA的酶學(xué)性質(zhì)分析
    5 小結(jié)與討論
第四章 結(jié)論與后續(xù)工作
    1 結(jié)論
    2 后續(xù)工作
附錄
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3763050