發(fā)布時間：2023-03-12 14:10

　　淀粉是水稻種子中含量最多(60%-90%)的儲能物質(zhì)。其含量及形態(tài)的變化對水稻產(chǎn)量及品質(zhì)有重大影響。淀粉的生物合成精密而復雜,有關淀粉合成的整體網(wǎng)絡機制及具體細節(jié)還未能清晰闡明,所以,挖掘與驗證新的影響淀粉合成的因子具有重要研究意義。我們從EMS誘變中花11的突變體庫中篩選到一個表型明顯且穩(wěn)定遺傳的堊白突變體ospk2,并進行了深入研究,主要結(jié)果如下:1.本研究中的突變體ospk2表現(xiàn)出心白表型,胚乳中間部位的淀粉顆粒之間排列松散;其灌漿速率明顯降低;成熟種子的總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降,蛋白和脂肪的含量明顯增多,支鏈淀粉的中短鏈(DP6-12)比例降低,中長鏈(DP13-25)有所增多,脂肪酸含量增加;膠稠度和米粉粘度明顯降低;ospk2突變體米粉在4M尿素溶液中的溶解膨脹度差異最大。結(jié)果充分表明OsPK2基因?qū)Φ久着呷橹械牡矸塾兄匾绊憽?.胚乳發(fā)育前期透射電鏡結(jié)果表明,ospk2突變體胚乳中復合淀粉顆粒的形成及造粉體發(fā)育存在異常。突變體內(nèi)既存在少量能正常膨大的淀粉顆粒,發(fā)育正常的造粉體;還存在大量的、小的、散亂的淀粉粒,多數(shù)淀粉單粒間間隙明顯,排列松散,無法形成復合顆粒。結(jié)果表...

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 淀粉的生物合成
        1.1.1 淀粉的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 淀粉的生物合成
    1.2 有關淀粉生物合成的調(diào)控
        1.2.1 淀粉合成的相關酶類的協(xié)同作用
        1.2.2 相關基因表達的調(diào)控
        1.2.3 其他基因的影響
    1.3 丙酮酸激酶(PK)的研究近況
        1.3.1 丙酮酸激酶在糖酵解途徑中的作用
        1.3.2 PKs的同工酶
        1.3.3 PKs亞基組成
        1.3.4 PKs的理化特性
        1.3.5 PKs的相關調(diào)控
        1.3.6 PKs家族
        1.3.7 植物PKs的相關研究
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 水稻堊白突變體ospk2的表型鑒定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 稻米產(chǎn)量性狀的測定
        2.1.3 測定水稻灌漿的動態(tài)過程中干物質(zhì)積累量
        2.1.4 掃描電鏡觀察成熟糙米的自然橫斷面
        2.1.5 發(fā)芽試驗
        2.1.6 胚乳半薄切片的制備及淀粉顆粒的染色觀察
        2.1.7 掃描電鏡觀察提取的胚乳淀粉顆粒
        2.1.8 動態(tài)胚乳的透射電鏡觀察
        2.1.9 總淀粉含量的測定
        2.1.10 直鏈淀粉含量的測定
        2.1.11 總蛋白含量的測定
        2.1.12 總脂肪含量的測定
        2.1.13 膠稠度測定
        2.1.14 RVA譜分析
        2.1.15 測定米粉的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)(鏈長分布)
        2.1.16 米粉尿素膨脹特性的檢測
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 ospk2突變體的表型鑒定
        2.2.2 觀察比較野生型ZH11與ospk2突變體的胚乳中復合淀粉顆粒
        2.2.3 測定野生型ZH11與ospk2突變體的淀粉相關理化性質(zhì)
    2.3 小結(jié)
        2.3.1 ospk2突變體胚乳出現(xiàn)明顯缺陷
        2.3.2 ospk2突變體的胚乳發(fā)育過程中復合淀粉顆粒的形成存在異常
        2.3.3 收獲一年的ospk2突變體種子的發(fā)芽率極顯著降低
        2.3.4 ospk2突變體胚乳中淀粉特性發(fā)生明顯變化
第三章 OsPK2基因的圖位克隆與功能互補
    3.1 材料與方法
        3.1.1 種植定位群體與挑選極端單株
        3.1.2 葉片總DNA的提取方法(SDS法及DNA快提法)
        3.1.3 PCR擴增
        3.1.4 8%PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測PCR產(chǎn)物
        3.1.5 開發(fā)與篩選具有的多態(tài)性分子標記及基因定位
        3.1.6 預測候選基因與測序
        3.1.7 構(gòu)建多種轉(zhuǎn)基因的表達載體及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.1.8 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定
        3.1.9 轉(zhuǎn)基因材料表型考察
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 ospk2突變體的遺傳分析
        3.2.2 OsPK2基因的圖位克隆和候選基因分析
        3.2.3 轉(zhuǎn)基因材料分析
    3.3 小結(jié)
        3.3.1 OsPK2是影響稻米淀粉合成的新基因
        3.3.2 OsPK2影響水稻胚乳中的復合淀粉顆粒的形態(tài)及存在
第四章 OsPK2的功能分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 進化樹構(gòu)建與氨基酸序列比對分析
        4.1.3 提取RNA與消化
        4.1.4 DNA第一鏈的合成
        4.1.5 Real-timePCR
        4.1.6 GUS活性染色
        4.1.7 快速提取胚乳蛋白及Westernblot檢測
        4.1.8 構(gòu)建亞細胞定位載體及大提質(zhì)粒
        4.1.9 轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體
        4.1.10 瞬時轉(zhuǎn)化煙草表皮細胞
        4.1.11 真核蛋白表達與純化
        4.1.12 組織蛋白的提取
        4.1.13 PK活性的測定
        4.1.14 丙酮酸含量測定
        4.1.15 酵母雙雜交
        4.1.16 雙分子熒光互補
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 OsPK2是一個高度保守的基因
        4.2.2 OsPK2基因的組織表達模式分析
        4.2.3 OsPK2的亞細胞定位分析
        4.2.4 OsPK2具有PK活性
        4.2.5 OsPK2能夠與其他三個假定的PKp蛋白互作,形成復合體
        4.2.6 OsPK2突變影響多種代謝相關基因的表達變化,導致代謝出現(xiàn)紊亂..
    4.3 小結(jié)
        4.3.1 OsPK2為組成型表達基因,定位在葉綠體中
        4.3.2 OsPK2編碼具有生物活性的PK
        4.3.3 OsPK2與其他假定的PK蛋白形成異源復合體
        4.3.4 OsPK2基因突變引起多重代謝相關基因表達量的改變
第五章 全文結(jié)論與討論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3761365