大量研究表明RNA結(jié)合蛋白在生殖細(xì)胞發(fā)生過程中扮演者重要角色,它通過調(diào)控RNA的各種活動,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達(dá)。果蠅how基因編碼產(chǎn)物為RNA結(jié)合蛋白,現(xiàn)在有許多研究結(jié)果表明該蛋白參與果蠅體內(nèi)多種活動進(jìn)程,如肌肉細(xì)胞的遷移、類固醇代謝、心率控制、性別決定以及中胚層分裂等等。本文主要研究held out wings(how)基因在生殖細(xì)胞中的功能,以及LC結(jié)構(gòu)域?qū)OW蛋白聚集的影響。首先,我們通過原核純化HOW蛋白免疫小鼠,獲得了 HOW蛋白鼠源抗體并通過Western Blot和免疫熒光染色分析了 HOW蛋白的表達(dá)情況。然后我們制備了 how基因敲低的轉(zhuǎn)基因果蠅,發(fā)現(xiàn)在其生殖細(xì)胞中特異性敲低how基因后,果蠅生殖干細(xì)胞丟失,并且隨著果蠅發(fā)育最終引起生殖細(xì)胞的全部丟失。接下來,我們研究了 LC結(jié)構(gòu)域?qū)OW蛋白的影響,我們發(fā)現(xiàn)LC結(jié)構(gòu)域不影響HOW蛋白在細(xì)胞中的定位。進(jìn)一步的通過半變性凝膠電泳試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)HOW蛋白的LC結(jié)構(gòu)域(QA-Rich)在很大程度上影響了該蛋白在體外的聚集,但是這種聚集與蛋白質(zhì)之間二硫鍵的形成沒有太大關(guān)系。在體外進(jìn)行的蛋白質(zhì)相變試驗(yàn)表明LC結(jié)構(gòu)域缺失...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 果蠅生殖干細(xì)胞
        1.1.1 果蠅雌性生殖干細(xì)胞
        1.1.2 果蠅雄性生殖干細(xì)胞
    1.2 基因編輯技術(shù)概況
        1.2.1 ZFNs介導(dǎo)的基因編輯
        1.2.2 TALENs介導(dǎo)的基因編輯
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯
    1.3 RNA結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的及意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 果蠅品系
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用菌株
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)所用主要引物
        2.1.7 溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Cas9/sgRNA方法制備突變體果蠅
        2.2.2 轉(zhuǎn)基因果蠅品系構(gòu)建
        2.2.3 用QIAGEN Plasmid Mini Kit中提質(zhì)粒
        2.2.4 Inoue法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.5 構(gòu)建載體
        2.2.6 質(zhì)粒小量提取
        2.2.7 原核蛋白表達(dá)及其純化
        2.2.8 質(zhì)粒大量提取
        2.2.9 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        2.2.10 半變性去垢劑瓊脂糖凝膠電泳法(SDD-AGE)
        2.2.11 蛋白質(zhì)相變(Protein Phase Separation)
        2.2.12 Trizol法提取蛋白質(zhì)
        2.2.13 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)
        2.2.14 果蠅基因組DNA提取
        2.2.15 果蠅卵巢和睪丸的免疫組織化學(xué)染色
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 果蠅HOW抗體的制備及HOW蛋白的表達(dá)分析
    3.2 how基因沉默后造成生殖細(xì)胞丟失
    3.3 LC結(jié)構(gòu)域的存在不影響HOW蛋白在細(xì)胞中的定位
    3.4 LC結(jié)構(gòu)域影響HOW在細(xì)胞內(nèi)聚集
    3.5 LC結(jié)構(gòu)域影響HOW蛋白在體外相變
    3.6 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建how突變體
4 討論
    4.1 how基因?qū)壍纳L發(fā)育是不可缺失的
    4.2 how基因?qū)壣称鞴俚陌l(fā)育是不可缺失的
    4.3 LC結(jié)構(gòu)域不影響HOW蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位
    4.4 HOW蛋白在體外有聚集現(xiàn)象
    4.5 LC結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渚奂l(fā)揮著一定作用
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
作者簡介



本文編號：3748645