鹽脅迫是世界范圍內(nèi)危害植物的主要逆境脅迫之一,嚴重抑制植物的生長和產(chǎn)量。柑橘是世界上以及我國南方重要的果樹種類之一,屬于對鹽極敏感的甜土植物,在中國柑橘主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)鹽害現(xiàn)象,在鹽脅迫下植株表現(xiàn)出失綠、葉尖焦枯、枯枝落葉、品質變劣,甚至死樹等癥狀(魏清江等,2015;Maas.,1993)。隨著工業(yè)污染加重和化肥使用不當?shù)热藶橐蛩氐某霈F(xiàn),鹽堿土面積在不斷增加,給柑橘生產(chǎn)帶來了重大的威脅。所以挖掘出與鹽脅迫相關基因,了解柑橘對鹽脅迫的響應及適應性機制,培育出抗逆性品種對生產(chǎn)具有重要意義。U-box蛋白廣泛存在于植物基因組中,其結構高度保守,在泛素降解途徑中發(fā)揮E3泛素連接酶的作用(Smalle et al.,2004),在非生物脅迫響應過程中具有重要作用(Vierstra.,2009)。已有研究表明植物U-box蛋白(Plant U-box protein,PUB)通過調控鹽脅迫響應基因的表達,提高植物體排Na⁺和保K⁺能力,維持體內(nèi)的Na⁺/K⁺平衡,最終提高植物的耐鹽性(李巧茹,2017)。因此,...

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文獻綜述
    1.1 土地鹽漬化
    1.2 鹽脅迫對植物的傷害
        1.2.1 水分虧缺
        1.2.2 離子毒害
        1.2.3 營養(yǎng)失衡
    1.3 鹽脅迫對植物生理的影響
        1.3.1 鹽脅迫對植物生長的影響
        1.3.2 鹽脅迫對植物光合作用的影響
        1.3.3 鹽脅迫對活性氧和抗氧化酶的影響
    1.4 柑橘對鹽脅迫的適應機制
        1.4.1 形態(tài)學的適應
        1.4.2 滲透調節(jié)物質合成
        1.4.3 ROS清除
    1.5 泛素/26S蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome pathway,UPP)
    1.6 U-box蛋白
        1.6.1 U-box蛋白的結構特點
        1.6.2 U-box蛋白的分類
        1.6.3 U-box蛋白的功能
    1.7 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展
        1.7.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結構及分類
        1.7.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應用
第2章 前言
    2.1 立題依據(jù)
    2.2 創(chuàng)新性
    2.3 技術路線
第3章 柑橘U-box基因家族的鑒定及表達分析
    3.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 柑橘U-box基因家族成員鑒定
        3.2.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進化及蛋白結構域分析
        3.2.3 柑橘U-box家族基因結構及Scaffold定位分析
        3.2.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析
        3.2.5 脅迫處理
        3.2.6 總RNA提取
        3.2.7 cDNA合成
        3.2.8 實時熒光定量PCR與數(shù)據(jù)分析
        3.2.9 柑橘U-box家族基因的冷脅迫表達模式分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 柑橘U-box基因家族成員信息
        3.3.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進化及蛋白結構域分析
        3.3.3 柑橘U-box家族基因結構及染色體定位分析
        3.3.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析
        3.3.5 U-box家族基因的表達分析
    3.4 討論
    3.5 小結
第4章 柑橘鹽脅迫基因CcPUB4的CRISPR/Cas9 載體構建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 載體及菌株
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑
        4.1.5 主要溶液的配制
        4.1.6 CcPUB4 基因的生物信息學分析
        4.1.7 枳殼和朱紅桔差異分析
        4.1.8 CcPUB4 基因g RNA靶位點設計
    4.2 CcPUB4 基因CRISPR/Cas9 載體構建
        4.2.1 BbsⅠ單酶切pP1C.
        4.2.2 pP1C.5 載體酶切產(chǎn)物回收
        4.2.3 引物退火形成雙鏈
        4.2.4 雙鏈g RNA連接到pP1C.5 載體
        4.2.5 連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌
        4.2.6 單克隆菌液PCR檢測
        4.2.7 pP1C.5 重組質粒提取
        4.2.8 pP1C.5 重組載體與pP1C.1C載體的雙酶切
        4.2.9 純化回收酶切后的片段
        4.2.10 目的片段與pP1C.1C載體連接與轉化
        4.2.11 單克隆菌液PCR檢測
        4.2.12 gRNA-1和g RNA-6 同時連接到pP1C.1C
        4.2.13 pP1C.1C重組載體轉化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細胞
        4.2.14 柑橘的遺傳轉化
        4.2.15 轉基因植株的鑒定
    4.3 結果與分析
        4.3.1 CcPUB4 基因的生物信息學分析
        4.3.2 枳殼和朱紅桔差異分析
            4.3.2.1 NaCl誘導枳殼朱紅桔中CcPUB4 基因表達分析
            4.3.2.2 枳殼和朱紅桔 CcPUB4 基因的 CDS 序列差異
        4.3.3 CcPUB4 基因的gRNA設計
        4.3.4 CRISPR/Cas9 載體的構建
        4.3.5 T0代CcPUB4 基因敲植株表型和突變鑒定
    4.4 討論
    4.5 結論
參考文獻
附錄
致謝
發(fā)表論文及參加課題



本文編號：3748489