鹽脅迫是世界范圍內(nèi)危害植物的主要逆境脅迫之一,嚴(yán)重抑制植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。柑橘是世界上以及我國(guó)南方重要的果樹(shù)種類之一,屬于對(duì)鹽極敏感的甜土植物,在中國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)鹽害現(xiàn)象,在鹽脅迫下植株表現(xiàn)出失綠、葉尖焦枯、枯枝落葉、品質(zhì)變劣,甚至死樹(shù)等癥狀(魏清江等,2015;Maas.,1993)。隨著工業(yè)污染加重和化肥使用不當(dāng)?shù)热藶橐蛩氐某霈F(xiàn),鹽堿土面積在不斷增加,給柑橘生產(chǎn)帶來(lái)了重大的威脅。所以挖掘出與鹽脅迫相關(guān)基因,了解柑橘對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)及適應(yīng)性機(jī)制,培育出抗逆性品種對(duì)生產(chǎn)具有重要意義。U-box蛋白廣泛存在于植物基因組中,其結(jié)構(gòu)高度保守,在泛素降解途徑中發(fā)揮E3泛素連接酶的作用(Smalle et al.,2004),在非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用(Vierstra.,2009)。已有研究表明植物U-box蛋白(Plant U-box protein,PUB)通過(guò)調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá),提高植物體排Na⁺和保K⁺能力,維持體內(nèi)的Na⁺/K⁺平衡,最終提高植物的耐鹽性(李巧茹,2017)。因此,...

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 土地鹽漬化
    1.2 鹽脅迫對(duì)植物的傷害
        1.2.1 水分虧缺
        1.2.2 離子毒害
        1.2.3 營(yíng)養(yǎng)失衡
    1.3 鹽脅迫對(duì)植物生理的影響
        1.3.1 鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響
        1.3.2 鹽脅迫對(duì)植物光合作用的影響
        1.3.3 鹽脅迫對(duì)活性氧和抗氧化酶的影響
    1.4 柑橘對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制
        1.4.1 形態(tài)學(xué)的適應(yīng)
        1.4.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成
        1.4.3 ROS清除
    1.5 泛素/26S蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome pathway,UPP)
    1.6 U-box蛋白
        1.6.1 U-box蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.6.2 U-box蛋白的分類
        1.6.3 U-box蛋白的功能
    1.7 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展
        1.7.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及分類
        1.7.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用
第2章 前言
    2.1 立題依據(jù)
    2.2 創(chuàng)新性
    2.3 技術(shù)路線
第3章 柑橘U-box基因家族的鑒定及表達(dá)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 柑橘U-box基因家族成員鑒定
        3.2.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)域分析
        3.2.3 柑橘U-box家族基因結(jié)構(gòu)及Scaffold定位分析
        3.2.4 柑橘U-box基因家族的啟動(dòng)子分析
        3.2.5 脅迫處理
        3.2.6 總RNA提取
        3.2.7 cDNA合成
        3.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與數(shù)據(jù)分析
        3.2.9 柑橘U-box家族基因的冷脅迫表達(dá)模式分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 柑橘U-box基因家族成員信息
        3.3.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)域分析
        3.3.3 柑橘U-box家族基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析
        3.3.4 柑橘U-box基因家族的啟動(dòng)子分析
        3.3.5 U-box家族基因的表達(dá)分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 柑橘鹽脅迫基因CcPUB4的CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 載體及菌株
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑
        4.1.5 主要溶液的配制
        4.1.6 CcPUB4 基因的生物信息學(xué)分析
        4.1.7 枳殼和朱紅桔差異分析
        4.1.8 CcPUB4 基因g RNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)
    4.2 CcPUB4 基因CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        4.2.1 BbsⅠ單酶切pP1C.
        4.2.2 pP1C.5 載體酶切產(chǎn)物回收
        4.2.3 引物退火形成雙鏈
        4.2.4 雙鏈g RNA連接到pP1C.5 載體
        4.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌
        4.2.6 單克隆菌液PCR檢測(cè)
        4.2.7 pP1C.5 重組質(zhì)粒提取
        4.2.8 pP1C.5 重組載體與pP1C.1C載體的雙酶切
        4.2.9 純化回收酶切后的片段
        4.2.10 目的片段與pP1C.1C載體連接與轉(zhuǎn)化
        4.2.11 單克隆菌液PCR檢測(cè)
        4.2.12 gRNA-1和g RNA-6 同時(shí)連接到pP1C.1C
        4.2.13 pP1C.1C重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞
        4.2.14 柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化
        4.2.15 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 CcPUB4 基因的生物信息學(xué)分析
        4.3.2 枳殼和朱紅桔差異分析
            4.3.2.1 NaCl誘導(dǎo)枳殼朱紅桔中CcPUB4 基因表達(dá)分析
            4.3.2.2 枳殼和朱紅桔 CcPUB4 基因的 CDS 序列差異
        4.3.3 CcPUB4 基因的gRNA設(shè)計(jì)
        4.3.4 CRISPR/Cas9 載體的構(gòu)建
        4.3.5 T0代CcPUB4 基因敲植株表型和突變鑒定
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
發(fā)表論文及參加課題



本文編號(hào)：3748489