二球懸鈴木(Platanus acerifolia)是我國(guó)城市綠化中最為重要的物種之一。其冠大蔭濃、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性較強(qiáng)、具有凈化空氣的能力,被人們稱之為行道樹之王。二球懸鈴木被廣泛種植于全球的各個(gè)城市,在園林建設(shè)中占據(jù)不可替代的作用。然而,二球懸鈴木果實(shí)成熟之后裂果所帶來的毛絮,嚴(yán)重影響到了城市的環(huán)境和人們的身心健康。近些年來,有很多的科研工作者在突變育種、枝條修剪等方面做了很多的研究,但都沒能從根本上解決二球懸鈴木落果飛毛的問題。隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,尤其是在利用基因工程創(chuàng)造不育植株中取得了很大的突破,為培育無球二球懸鈴木帶來了新的希望。自ABC模型提出以來,研究人員對(duì)花器官發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)做了深入分析,使花發(fā)育相關(guān)的研究從形態(tài)描述及生理層次,深入到了分子調(diào)節(jié)水平。隨著對(duì)二球懸鈴木開花相關(guān)基因的克隆,對(duì)其成花機(jī)理的了解也越來越透徹。深入了解這些花器官形成基因的調(diào)控機(jī)理,可以更好地將這些遺傳資源應(yīng)用到二球懸鈴木等園林植物的育種中。本課題以二球懸鈴木為實(shí)驗(yàn)材料,采用了TAIL-PCR的方法分離了二球懸鈴木中花發(fā)育B類兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列,采用生物信息、啟動(dòng)子截短、GUS蛋白染...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物花發(fā)育相關(guān)基因的研究進(jìn)展
        1.1.1 植物花發(fā)育的模型
        1.1.2 同源異型框B類基因
        1.1.3 同源異型框D類基因
        1.1.4 二球懸鈴木中花器官同源異型基因相關(guān)研究
    1.2 真核生物啟動(dòng)子研究進(jìn)展
        1.2.1 真核生物啟動(dòng)子組成
        1.2.2 啟動(dòng)子的順式元件
        1.2.3 植物啟動(dòng)子的類型
            1.2.3.1 組成型啟動(dòng)子
            1.2.3.2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
            1.2.3.3 組織特異性啟動(dòng)子
        1.2.4 啟動(dòng)子克隆方法
            1.2.4.1 啟動(dòng)子探針篩選基因組
            1.2.4.2 啟動(dòng)子捕獲
            1.2.4.3 反向PCR
            1.2.4.4 熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR
        1.2.5 啟動(dòng)子研究策略
            1.2.5.1 生物信息學(xué)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析
            1.2.5.2 組織化學(xué)染色及熒光分析
            1.2.5.3 缺失分析
            1.2.5.4 凝膠阻滯試驗(yàn)
            1.2.5.5 酵母單雜交技術(shù)
            1.2.5.6 染色質(zhì)免疫共沉淀法
            1.2.5.7 定點(diǎn)突變分析
    1.3 BARNASE基因研究及應(yīng)用
        1.3.1 BARNASE基因的分離及活性分析
        1.3.2 BARNASE基因的在植物基因工程中的應(yīng)用
    1.4 本課題的研究目的和意義
第二章 二球懸鈴木B類基因AP3啟動(dòng)子的克隆及其功能分析
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 植物材料
        2.2.2 菌株、載體和感受態(tài)細(xì)胞
        2.2.3 主要試劑與藥品
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)引物
        2.2.5 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.5.1 啟動(dòng)子pPaAP3的分離克隆
            2.2.5.2 生物信息學(xué)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析
            2.2.5.3 啟動(dòng)子pPaAP3及系列 5’缺失表達(dá)載體構(gòu)建
            2.2.5.4 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.5.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株陽性檢測(cè)
            2.2.5.6 GUS蛋白組織化學(xué)染色
            2.2.5.7 RNA的抽提
            2.2.5.8 RT-PCR檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 啟動(dòng)子pPaAP3的克隆及序列分析
        2.3.2 啟動(dòng)子pPaAP3不同缺失片段表達(dá)的載體構(gòu)建
        2.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的陽性檢測(cè)
        2.3.4 組織化學(xué)染色分析啟動(dòng)子各缺失片段的表達(dá)模式
        2.3.5 RT-PCR檢測(cè)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)模式
    2.4 討論
第三章 二球懸鈴木B類基因PI啟動(dòng)子的克隆及其功能分析
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 植物材料
        3.2.2 菌株、載體和感受態(tài)細(xì)胞
        3.2.3 主要試劑與藥品
        3.2.4 主要實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.4.1 啟動(dòng)子pPaPI的分離克隆
            3.2.4.2 生物信息學(xué)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析
            3.2.4.3 啟動(dòng)子pPaPI及系列 5’缺失表達(dá)載體構(gòu)建
            3.2.4.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化和陽性檢測(cè)
            3.2.4.5 GUS蛋白染色和RNA抽提等方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 啟動(dòng)子pPaPI的克隆及序列分析
        3.3.2 啟動(dòng)子pPaPI不同缺失片段表達(dá)的載體構(gòu)建
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的陽性檢測(cè)
        3.3.4 組織化學(xué)染色分析啟動(dòng)子各缺失片段的表達(dá)模式
        3.3.5 RT-PCR檢測(cè)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)模式
    3.4 討論
第四章 二球懸鈴木B類基因PaAP3和PaPI組織特異性啟動(dòng)子在不育植株構(gòu)建中的應(yīng)用
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.2.1 啟動(dòng)子表達(dá)載體pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的構(gòu)建
            4.2.2.2 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)
            4.2.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草表型植株RT-PCR檢測(cè)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 表達(dá)載體pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的構(gòu)建
        4.3.2 表達(dá)載體pPaAP3-p8::BARNASE轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀測(cè)
        4.3.3 表達(dá)載體pPaPI-p5::BARNASE轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀測(cè)
        4.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草表型植株RT-PCR檢測(cè)
    4.4 討論
        4.4.1 表達(dá)載體pPaAP3-p8::BARNASE、pPaPI-p5::BARNASE轉(zhuǎn)基因煙草的表型比較
        4.4.2 表達(dá)載體pPaAP3-p8::BARNASE和pPaPI-p5::BARNASE的功能分析及應(yīng)用
第五章 二球懸鈴木D類基因PaSTK的同源克隆與表達(dá)分析
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            5.2.2.1 PaSTK核心保守片段同源擴(kuò)增
            5.2.2.2 采用TAIL-PCR結(jié)合 3’ RACE克隆PaSTK基因全長(zhǎng)
            5.2.2.3 基于二球懸鈴木PaSTK基因編碼區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)樹
            5.2.2.4 熒光定量檢測(cè)PaSTK在二球懸鈴木各組織中的表達(dá)模式
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 PaSTK基因核心保守片段擴(kuò)增及同源比對(duì)
        5.3.2 PaSTK基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域分析
        5.3.3 基于二球懸鈴木PaSTK基因編碼區(qū)的進(jìn)化樹構(gòu)建
        5.3.4 熒光定量檢測(cè)PaSTK在二球懸鈴木各組織中的表達(dá)模式
    5.4 討論
第六章 二球懸鈴木D類基因PaSTK啟動(dòng)子的克隆、功能分析及其在不育植物構(gòu)建中的應(yīng)用
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 植物材料
        6.2.2 菌株、載體和感受態(tài)細(xì)胞
        6.2.3 主要試劑與藥品
        6.2.4 實(shí)驗(yàn)方法
            6.2.4.1 啟動(dòng)子pPaSTK的分離克隆
            6.2.4.2 生物信息學(xué)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析
            6.2.4.3 啟動(dòng)子表達(dá)載體pPaSTK::GUS表達(dá)載體的構(gòu)建
            6.2.4.4 啟動(dòng)子表達(dá)載體PaSTK::BARNASE的構(gòu)建
            6.2.4.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)
            6.2.4.6 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定pPaSTK::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS蛋白活性
            6.2.4.7 PaSTK::BARNASE轉(zhuǎn)基因擬南芥表型植株RT-PCR檢測(cè)
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 啟動(dòng)子pPaSTK的克隆及序列分析
        6.3.2 啟動(dòng)子表達(dá)載體pPaSTK::GUS的構(gòu)建
        6.3.3 PaSTK::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性檢測(cè)
        6.3.4 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定pPaSTK::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS蛋白活性
        6.3.5 表達(dá)載體pPaSTK::BARNASE的構(gòu)建
        6.3.6 表達(dá)載體pPaSTK::BARNASE轉(zhuǎn)基因擬南芥植株RT-PCR檢測(cè)
        6.3.7 表達(dá)載體pPaSTK::BARNASE轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀測(cè)
    6.4 討論
第七章 總結(jié)與展望
    7.1 總結(jié)
        7.1.1 啟動(dòng)子的克隆策略
        7.1.2 啟動(dòng)子的研究策略
        7.1.3 二球懸鈴木啟動(dòng)子pPaAP3的特征及應(yīng)用
        7.1.4 二球懸鈴木啟動(dòng)子pPaPI的特征及應(yīng)用
        7.1.5 二球懸鈴木啟動(dòng)子pPaSTK的特征及應(yīng)用
        7.1.6 二球懸鈴木落果飛毛問題的改良
        7.1.7 二球懸鈴木遺傳轉(zhuǎn)化研究
    7.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 改良的CTAB法提取基因組DNA
附錄B 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA（小量法）
附錄C 大腸桿菌熱激感受態(tài)的制備及熱激法轉(zhuǎn)化
附錄D 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化步驟
附錄E 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
附錄F 煙草、擬南芥總RNA的提取
附錄G mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA步驟
附錄H 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定GUS蛋白活性
附錄I GENBANK注冊(cè)基因登錄號(hào)
附錄J PaSTK同源基因列表
博士在讀期間已發(fā)表文章
致謝



本文編號(hào)：3746746