葉綠體的正常發(fā)育對(duì)于植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。葉色突變體的研究是探明葉綠體發(fā)育過程中基因功能的有效途徑。近年來,葉色突變相關(guān)基因的研究已取得較好進(jìn)展,對(duì)水稻葉色突變體的報(bào)道主要包括黃化、白化、亮綠、條斑條紋、溫敏變色、轉(zhuǎn)綠和轉(zhuǎn)紫等。在前期的研究中,用⁶⁰Co-γ射線輻射的秈稻9311后代中篩選到一個(gè)黃葉突變體。以黃葉突變體和野生型為材料,結(jié)合重測(cè)序、圖位克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),在圖位克隆定位的區(qū)間內(nèi)篩選到13個(gè)差異表達(dá)的基因,為了進(jìn)一步確定各個(gè)基因是否與黃葉突變有關(guān),本研究開展的工作及其結(jié)果如下:1.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建水稻黃葉突變體候選基因的編輯載體及其遺傳轉(zhuǎn)化。利用黃葉候選基因的外顯子區(qū)域2個(gè)不同靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)合成特異引物,構(gòu)建了13個(gè)候選基因的pC1300-Cas9編輯載體。將構(gòu)建成功的載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式遺傳轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴,而BGIOSGA012976和BGIOSGA010427的基因編輯載體同時(shí)轉(zhuǎn)化9311品種。除了BGIOSGA010427(受體9311)、BGIOSGA010449、BGIOSGA012911、BGIOSGA0129...

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文章綜述
    1.1 葉色形成研究進(jìn)展
        1.1.1 葉色突變的來源及分類
        1.1.2 葉綠體合成途徑
        1.1.3 葉綠體降解途徑
        1.1.4 水稻葉色突變相關(guān)基因的研究進(jìn)展
        1.1.5 水稻葉色突變的研究意義及應(yīng)用
    1.2 CRISPR/Cas9 概述
    1.3 RNA干涉概述
    1.4 本研究的主要內(nèi)容、目的及意義
第二章 水稻黃葉候選基因敲除載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株和載體
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑配方
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 基因的生物信息學(xué)分析
        2.3.2 基因編輯目的序列的選擇
        2.3.3 SK-gRNA重組載體構(gòu)建
        2.3.4 pC1300-Cas9-12976 重組載體構(gòu)建及陽性鑒定
        2.3.5 pC1300-Cas9-12976 重組載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及陽性鑒定
        2.3.6 根癌農(nóng)桿菌EHA105 介導(dǎo)的pC1300-Cas9 重組載體的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.7 轉(zhuǎn)基因T0代植株的陽性鑒定
        2.3.8 轉(zhuǎn)基因陽性植株中黃葉突變候選基因編輯檢測(cè)
        2.3.9 T0-Cas9-12976 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.4.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果
        2.4.2 靶序列選擇及引物設(shè)計(jì)
        2.4.3 SK-gRNA-12976 重組載體構(gòu)建及陽性鑒定
        2.4.4 pC1300-Cas12976 重組載體構(gòu)建及陽性鑒定
        2.4.5 pC1300-Cas9-12976 重組載體農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化及陽性鑒定
        2.4.6 基因編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4.7 T0轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定
        2.4.8 轉(zhuǎn)基因植株中靶基因的檢測(cè)
        2.4.9 T0-Cas9-12976 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察
    2.5 討論
第三章 兩個(gè)水稻黃葉候選基因RNA干涉表達(dá)載體及遺傳轉(zhuǎn)化
    3.1 引言
    3.2 材料及方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)菌株與載體
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑配方
        3.2.5 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 RNAi引物的設(shè)計(jì)
        3.3.2 9311總RNA的提取及RNA反轉(zhuǎn)
        3.3.3 干涉表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.4 RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        3.3.5 RNAi表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.4.1 9311cDNA Actin檢測(cè)
        3.4.2 目的基因第一鏈與DS1301 的組裝
        3.4.3 目的基因第二鏈與重組載體DS1301 的組裝
        3.4.4 RNA干涉表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        3.4.5 RNA干涉表達(dá)載體的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        3.4.6 RNA干涉表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定及表型觀察
    3.5 討論
第四章 兩個(gè)水稻黃葉候選基因超表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株和載體
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑配方
        4.2.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 超表達(dá)載體引物的設(shè)計(jì)
        4.3.2 9311RNA的提取及RNA反轉(zhuǎn)
        4.3.3 超表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.4 超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化
        4.3.5 超表達(dá)載體的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 目的基因的擴(kuò)增
        4.4.2 TA克隆陽性鑒定
        4.4.3 TA重組載體和pCAMBIA1302 載體質(zhì)粒DNA的酶切
        4.4.4 陽性克隆鑒定
        4.4.5 超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化
        4.4.6 超表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化
    4.5 討論
致謝
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
參與的學(xué)術(shù)會(huì)議



本文編號(hào)：3744949