發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 09:09

  本文關(guān)鍵詞：牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究旨在研究Tp53(Tumor protein Tp53)基因在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢和早期不同發(fā)育時(shí)期體外受精胚胎中的表達(dá)情況及其與體外受精胚胎發(fā)育的關(guān)系。采集牦牛卵巢,收集牦牛A、B級(jí)卵母細(xì)胞,通過體外成熟培養(yǎng)及對(duì)成熟卵母細(xì)胞體外受精后進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)黃牛的基因序列設(shè)計(jì)5’到3’端特異性引物,采用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)和間接免疫熒光方法檢測不同時(shí)期卵巢和體外受精胚胎發(fā)育過程中Tp53在基因和蛋白水平的表達(dá)動(dòng)態(tài),并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)等其他生物信息進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明:(1)Tp53主要存在于細(xì)胞核中,少量存在于細(xì)胞質(zhì)中,其作用和DNA的損傷有關(guān)。(2)本研究首次成功克隆獲得了全長為1287 bp的牦牛Tp53基因cDNA,并將該基因序列提交到了GenBank,KR185965。(3)同源性分析表明,牦牛Tp53基因與瘤牛的相應(yīng)序列同源性最高,表明Tp53基因在進(jìn)化中具有高度保守性。;牦牛Tp53蛋白同源建模形成一個(gè)由α螺旋環(huán)繞β折疊片的3D結(jié)構(gòu)。(4)Tp53基因在不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)情況與卵泡顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、凋亡及卵巢內(nèi)分泌有關(guān)。從本研究可以看出,Tp53基因在牦牛體外受精早期胚胎和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中均有表達(dá),表明Tp53基因在生殖過程中有重要作用。Tp53的表達(dá)量與胚胎發(fā)育阻斷的發(fā)生幾率成正相關(guān),其作用可能和DNA的損傷有關(guān)。在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中Tp53的表達(dá)量出現(xiàn)差異可能是由于DNA損傷程度及內(nèi)分泌等因素的不同所致。牦牛Tp53基因的成功克隆及生物信息學(xué)分析為該基因的進(jìn)一步研究奠定了一定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牦牛 體外受精 胚胎 卵巢 基因克隆 生物信息學(xué) Tp53
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823.85
【目錄】：

• 摘要4-5
• SUMMARY5-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-17
• 1 牦牛概況10-11
• 2 Tp53基因的研究進(jìn)展11-12
• 2.1 Tp53基因的結(jié)構(gòu)及活化方式11-12
• 2.2 Tp53基因的生物學(xué)功能12
• 3 卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)的研究進(jìn)展12-13
• 4 不同發(fā)情時(shí)期卵巢特征13-14
• 4.1 紅體期卵巢特征14
• 4.2 黃體期卵巢特征14
• 4.3 卵泡期卵巢特征14
• 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-q PCR）及其應(yīng)用14-16
• 5.1 RT-q PCR體系的建立14-15
• 5.2 RT-q PCR的應(yīng)用15-16
• 6 免疫熒光染色技術(shù)及其應(yīng)用16-17
• 7 本研究的研究目的及意義17
• 第二部分 牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)17-46
• 實(shí)驗(yàn)一 腫瘤抑制蛋白Tp53在牦牛體外受精早期胚胎中的表達(dá)17-29
• 1 材料18-20
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料18
• 1.2 主要試劑18-19
• 1.3 主要儀器19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.1 Tp53基因在牦牛早期體外受精胚胎中表達(dá)差異的測定20-23
• 2.1.1 牦牛卵母細(xì)胞的收集及卵母細(xì)胞體外成熟20
• 2.1.2 卵母細(xì)胞體外受精及胚胎體外培養(yǎng)20-21
• 2.1.3 各個(gè)時(shí)期胚胎總RNA的提取及合成c DNA21
• 2.1.4 PCR檢測Tp53的表達(dá)21-22
• 2.1.5 RT-q PCR檢測Tp53的表達(dá)22
• 2.1.6 間接免疫熒光染色及檢測Tp53的表達(dá)22-23
• 2.1.7 數(shù)據(jù)分析23
• 3 結(jié)果23-27
• 3.1 體外受精胚胎在不同時(shí)期的發(fā)育23-24
• 3.2 Tp53基因在不同發(fā)育時(shí)期體外受精胚胎中的表達(dá)情況24-27
• 4 討論27-29
• 5 結(jié)論29
• 實(shí)驗(yàn)二 牦牛Tp53基因 特征分析及其在不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)29-46
• 1 材料30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料30
• 1.2 主要試劑及主要儀器30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 2.1 不同時(shí)期卵巢RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄30
• 2.2 引物設(shè)計(jì)30-31
• 2.3 牦牛Tp53基因的擴(kuò)增與克隆31-32
• 2.3.1 PCR產(chǎn)物膠回收及純化31-32
• 2.3.2 連接32
• 2.3.3 轉(zhuǎn)化32
• 2.3.4 陽性克隆PCR擴(kuò)增鑒定及測序32
• 2.4 生物信息學(xué)分析32
• 2.5 Real-time PCR測定Tp53在牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)情況32-33
• 3 結(jié)果與分析33-44
• 3.1 牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢中Tp53基因的表達(dá)33
• 3.2 基因重組子鑒定33-34
• 3.3 Tp53序列的測定34
• 3.4 氨基酸序列分析34-38
• 3.4.1 Tp53的基本理化性質(zhì)分析34-35
• 3.4.2 腫瘤抑制蛋白Tp53磷酸化位點(diǎn)的分析35-38
• 3.5 牦牛Tp53空間結(jié)構(gòu)38-40
• 3.6 核苷酸進(jìn)化樹的建立及同源性比較40-42
• 3.7 Real-time PCR結(jié)果42-44
• 4 討論44-45
• 5 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 附錄52-57
• 附錄1 各個(gè)時(shí)期胚胎總RNA的提取及合成c DNA52-54
• 附錄2 兩步法c DNA合成步驟54-55
• 附錄3 PCR產(chǎn)物膠回收及純化55-56
• 附錄4 轉(zhuǎn)化過程56-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58-59
• 導(dǎo)師簡介59-61

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：牦牛Tp53基因特征及其在早期IVF胚胎和不同發(fā)情時(shí)期卵巢中的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：372974