本文關鍵詞：橡膠轉移酶HRT2基因轉錄因子的鑒定及分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：世界所需的天然橡膠主要來自巴西橡膠樹。乳管是橡膠樹中合成天然橡膠的一種特化的分泌組織,由乳管細胞構成。乳管細胞中的橡膠粒子是合成天然橡膠的細胞器。天然橡膠的生物合成是典型的植物類異戊二烯代謝途徑,其中一個主要反應就是橡膠烴鏈的延伸。至今對橡膠烴延伸的生化機制還不清楚,但認為異戊烯基轉移酶(橡膠轉移酶)是不可缺少的。有證據(jù)表明,橡膠轉移酶HRT2在天然橡膠合成中起重要作用,但對該酶的轉錄調節(jié)還了解不多。本研究擬鑒定橡膠轉移酶HRT2基因的轉錄因子,為研究天然橡膠生物合成調控機制奠定基礎。主要研究結果：(1)在橡膠合成效率存在明顯差異的橡膠樹品種熱研8-79和PR107中,橡膠合成關鍵酶HbFDPS、HbSRPP、HbHRT2的基因表達也存在明顯差異,其中HbHRT2基因表達量差異最大。(2)從熱研8-79和PR107的膠乳比較轉錄組數(shù)據(jù)中篩選到一個差異基因片段,通過熒光定量PCR實驗驗證其在橡膠樹品種熱研8-79、PR107中存在差異性,在熱研8-79中表達量約為PR107的1.7倍。(3)克隆了差異基因的全長cDNA序列,序列分析顯示基因該片段cDNA全長1105bp,開放閱讀框長714bp,編碼237個氨基酸。氨基酸序列的第1～60位氨基酸含有MADS蛋白結構域,表明該基因屬于MADS-box類蛋白,命名為HbMADS3-2,進化樹分析表明該蛋白與麻風樹、蓖麻的MADS蛋白同源性分別達到了80%、82%。(4)基因表達分析發(fā)現(xiàn),HbMADS3-2在不同組織中表達存在差異：在膠乳中表達量最高,在花和葉中呈現(xiàn)微弱表達,在根、果、幼莖中不表達。茉莉酸上調HbMADS3-2基因表達,但乙烯處理除了在2h時上調其表達,在1-3d下調其表達。(5)生物信息學分析表明,HbHRT2基因和HbSRPP基因啟動子含有MADS-box結合的CArG-box元件,HbFDPS基因啟動子未鑒定到該元件。進一步構建了pGADT7-HbMAD3-2酵母單雜交載體,通過酵母點對點雜交實驗鑒定到HbMADS3-2結合橡膠轉移酶基因HRT2啟動子,表明HbMADS3-2是橡膠轉移酶基因HRT2的轉錄因子。(6)通過酵母雙雜交實驗篩選到與HblMYC3的互作蛋白HblMYC2,HblMYC2與已經(jīng)鑒定到的橡膠轉移酶基因HRT2的一個轉錄因子HbMYC序列一致,兩者為同一基因。但是,通過酵母單雜點對點實驗證明,HblMYC3不能與HbHRT2基因的啟動子結合。結論：HRT2基因在橡膠合成效率高的橡膠樹品種熱研8-79中的表達量顯著高橡膠合成效率低的橡膠樹品種PR107。其轉錄受多種轉錄因子調節(jié),除了HbEIN3-1外,還有HblMYC2、HblMYC3和HbMADS3-2。這些轉錄因子可能形成一個復合體,介導乙烯和茉莉酸信號途徑對HRT2基因的精細轉錄調控。
【關鍵詞】：巴西橡膠樹 橡膠轉移酶HRT2 酵母單雜交 HbMADS3-2 HblMYC3
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S794.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1. 前言10-21
• 1.1 天然橡膠的生物合成10-11
• 1.2 橡膠生物合成關鍵酶11-14
• 1.2.1 橡膠延伸因子(REF)和小橡膠粒子蛋白11-12
• 1.2.2 HMG-CoA還原酶(HMGR)12
• 1.2.3 法尼基焦磷酸合成酶12-13
• 1.2.4 橡膠轉移酶13-14
• 1.2.4.1 橡膠樹轉移酶HRT2基因轉錄因子的研究進展14
• 1.3 茉莉酸的生物合成及生理功能14-15
• 1.3.1 茉莉酸對植物次生代謝途徑的調控14
• 1.3.2 MYC轉錄因子14-15
• 1.4 植物MADS-box基因研究進展15-17
• 1.4.1 植物MADS-box的基因結構15-16
• 1.4.2 MADS-box蛋白的轉錄調控機制16
• 1.4.3 橡膠樹中MADS蛋白的研究進展16-17
• 1.5 酵母雜交技術的研究進展17-19
• 1.5.1 酵母雙雜交原理17
• 1.5.2 酵母雙雜交應用17
• 1.5.3 酵母單雜交17-18
• 1.5.4 酵母單雜交的應用18-19
• 1.6 本研究的目的意義19-20
• 1.7 技術路線20-21
• 2. 方法21-38
• 2.1 植物材料21
• 2.2 載體、質粒和菌種21-22
• 2.3 酵母培養(yǎng)基22
• 2.4 其他試劑22
• 2.5 HbMADS3-2、HbFDPS、HbHRT2、HbSRPP在橡膠樹熱研8-79、PR107的基因表達22-26
• 2.5.1 樣品的采集22
• 2.5.2 橡膠樹總RNA的提取22-23
• 2.5.3 cDNA第一鏈的合成23-24
• 2.5.4 熒光定量PCR24-26
• 2.6 酵母單雜交表達載體pGADT7-HbMADS3-2的構建26-30
• 2.6.1 5'-RACE26-28
• 2.6.2 HbMADS3-2全長cDNA的克隆28-29
• 2.6.3 HbMADS3-2酵母單雜交表達載體的構建29-30
• 2.7 酵母單雜交點對點驗證HbMADS3-2與HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP之間的互作30-32
• 2.7.1 酵母Y187感受態(tài)的制備30-31
• 2.7.2 pGADT7-HbMADS3-2與HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP共轉化酵母感受態(tài)31-32
• 2.8 不同激素處理對HbMADS3-2基因表達影響32
• 2.8.1 材料的處理32
• 2.8.2 不同處理下HbMADS3-2的基因表達32
• 2.9 利用酵母雙雜交篩選HblMYC3的互作蛋白32-37
• 2.9.1 pGBKT7-HblMYC3酵母雙雜交載體的構建32-33
• 2.9.2 膠乳cDNA文庫的構建33-35
• 2.9.3 誘餌載體pGBKT7-HblMYC3與膠乳cDNA文庫雙雜交35
• 2.9.4 誘餌載體pGBKT7-HblMYC3自激活作用的鑒定35
• 2.9.5 酵母菌陽性菌株的鑒定35-37
• 2.10 酵母單雜交點對點驗證HblMYC3與橡膠轉移酶基因HRT2啟動子之間的互作37-38
• 2.10.1 酵母單雜交載體pGADT7-HblMYC3的構建37
• 2.10.2 雙酶切、連接37
• 2.10.3 pGADT7-HblMYC3與pHis2.1-HRT2點對點酵母單雜交37-38
• 3. 結果38-51
• 3.1 HbMADS3-2酵母單雜表達載體的構建38-41
• 3.1.1 HbMADS3-2、HbFDPS、HbHRT2、HbSRPP在橡膠樹熱研8-79、PR107的基因表達38-39
• 3.1.2 5'RACE擴增39
• 3.1.3 HbMADS3-2全長cDNA的擴增39
• 3.1.4 HbMADS3-2的生物信息學分析39-41
• 3.1.5 HbMADS3-2分子進化樹分析41
• 3.2 HbMADS3-2基因表達分析41-43
• 3.2.1 HbMADS3-2基因在不同組織中的表達分析41-42
• 3.2.2 不同激素處理對HbMADS3-2表達的影響42-43
• 3.3 酵母單雜點對點驗證HbMADS3-2與HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP之間的互作關系43-46
• 3.3.1 HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP啟動子元件分析43
• 3.3.2 pGADT7-HbMADS3-2酵母單雜表達載體的構建43
• 3.3.3 HbMADS3-2和HbHRT2、HbFDPS、HbSRPP點對點酵母單雜交43-46
• 3.4 酵母雙雜篩選互作蛋白HblMYC346-49
• 3.4.1 重組pGBKT7-HblMYC3誘餌表達載體構建與驗證46
• 3.4.2 重組質粒pGBKT7-HblMYC3自激活檢測46-47
• 3.4.3 HbIMYC3酵母菌文庫的篩選及侯選質粒的分離47-48
• 3.4.4 HbIMYC3酵母菌文庫侯選蛋白的測序及分析48-49
• 3.5 酵母單雜點對點驗證HblMYC3是否為HbHRT2轉錄因子49-51
• 3.5.1 酵母單雜表達載體pGADT7-HblMYC3的構建與驗證49
• 3.5.2 HblMYC3、HbHbHRT2點對點酵母單雜交49-51
• 4. 討論51-53
• 4.1 HbHRT2的差異表達可能與橡膠合成效率高低有關51
• 4.2 HbMADS3-2在乳管細胞中大量表達,而且受茉莉酸上調表達,可能與橡膠合成調控有關51-52
• 4.3 HbHRT2的轉錄受多個轉錄因子調節(jié),這些轉錄因子可能形成一個復合體,介導乙烯和茉莉酸信號途徑對天然橡膠生物合成的調節(jié)52-53
• 5. 結論53
• 6. 創(chuàng)新53
• 7. 后續(xù)研究53-54
• 參考文獻54-63
• 附錄63-68
• 致謝68

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：橡膠轉移酶HRT2基因轉錄因子的鑒定及分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：372534