發(fā)布時間：2023-01-08 15:57

　　鹽脅迫會導致棉花生長發(fā)育遲緩,產(chǎn)量顯著下降。植物排鈉的機制有以下三種,降低鈉離子內(nèi)流轉(zhuǎn)運蛋白等基因的表達,進入細胞的鈉離子被運輸和儲存在液泡中,細胞質(zhì)中的Na⁺可以通過質(zhì)膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運到外部介質(zhì)或質(zhì)外體。通過比對耐鹽和敏鹽棉花材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)在耐鹽材料固有基因BASS5（膽汁酸:Na⁺共轉(zhuǎn)運體,BASS是一類依賴Na⁺梯度共轉(zhuǎn)運小分子酸的膜通道蛋白）的表達量顯著低于敏鹽棉花材料。BASS5是一個鈉依賴型轉(zhuǎn)運蛋白,但其在鹽脅迫中的作用尚未有報道。為了研究該基因在棉花鹽脅迫中的功能,本試驗構(gòu)建了GFP熒光定位載體,合成GhBASS5的抗體運用免疫熒光組織定位的方法,確定其亞細胞和亞組織定位,利用VIGS（Virus induced gene silencing）技術(shù)侵染棉花,得到GhBASS5基因沉默的棉花植株,模擬鹽脅迫處理觀察并統(tǒng)計幼苗生長期的生理生化實驗以及運用NMT測定根部鈉離子流。結(jié)果如下:1.從陸地棉品種“中棉所ZG-5”中克隆到目的基因:一個下... 

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 棉花耐鹽性研究概況
        1.1.1 鹽脅迫及其對棉花影響的范圍
        1.1.2 高鹽對棉花生長的影響
        1.1.3 鹽脅迫制約棉花生長發(fā)育的機制
    1.2 植物耐鹽研究
    1.3 BASS基因的研究進展
        1.3.1 BASS的研究現(xiàn)狀
        1.3.2 BASS的蛋白結(jié)構(gòu)
    1.4 質(zhì)體在植物耐鹽中的作用
    1.5 NMT的原理及研究現(xiàn)狀
    1.6 本研究的目的及意義
2 GhBASS5基因的分子克隆與鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株、質(zhì)粒和載體
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 常用試劑及酶
        2.1.5 引物及測序
    2.2 實驗方法
        2.2.1 棉花基因組DNA的提取及檢測
        2.2.2 棉花基因組RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 克隆棉花GhBASS5基因
        2.2.4 GhBASS5氨基酸同源序列比對分析以及進化樹的構(gòu)建
        2.2.5 GhBASS5基因的組織特征表達分析
        2.2.6 GhBASS5蛋白的亞細胞和亞組織定位
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 棉花GhBASS5基因的克隆
        2.3.2 GhBASS5蛋白同源序列比對分析
        2.3.3 GhBASS5的氨基酸序列進化樹的構(gòu)建
        2.3.4 棉花GhBASS5基因的組織表達特征分析
        2.3.5 棉花GhBASS5蛋白的亞細胞定位
        2.3.6 棉花GhBASS5蛋白免疫熒光亞組織定位
    2.4 討論
3 沉默GhBASS5基因提高陸地棉耐鹽性
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株、質(zhì)粒載體
        3.1.3 常用試劑及酶
        3.1.4 培養(yǎng)基,抗生素以及重懸液的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 含有目的基因片段的沉默載體VIGS-GhBASS5構(gòu)建
        3.2.2 棉花VIGS體系的構(gòu)建
        3.2.3 轉(zhuǎn)化植株GhBASS5基因表達水平的檢測
        3.2.4 沉默GhBASS5基因的陸地棉鹽脅迫處理
        3.2.5 棉花葉片中葉綠素含量的測定
        3.2.6 棉花葉片中脯氨酸含量的測定
        3.2.7 棉花葉片中丙二醛含量的測定
        3.2.8 棉花葉片中可溶性糖的測定
        3.2.9 棉花葉片中超氧離子、過氧化氫含量和氧化物酶含量及其基因表達水平的測定
        3.2.10 棉花根中超氧離子、過氧化氫含量及過氧化物基因表達水平的測定
        3.2.11 BASS家族基因,耐鹽相關(guān)基因和離子運輸相關(guān)基因的表達量分析
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 病毒誘導基因沉默載體的構(gòu)建
        3.3.2 棉花GhBASS5基因沉默植株表型分析
        3.3.3 目標基因表達水平的檢測
        3.3.4 鹽脅迫對GhBASS5基因沉默的棉花表型的影響
        3.3.5 鹽脅迫對棉花葉綠素含量的影響
        3.3.6 鹽脅迫對棉花丙二醛含量的影響
        3.3.7 鹽脅迫對棉花可溶性糖含量的影響
        3.3.8 鹽脅迫下棉花脯氨酸含量的測定
        3.3.9 鹽脅迫對棉花根部O_2~-和H_2O_2及過氧化物基因表達水平的影響
        3.3.10 鹽脅迫對棉花葉片O_2~-和H_2O_2及過氧化物含量和基因表達水平的影響
        3.3.11 鹽脅迫對BASS家族,脅迫響應(yīng)和離子運輸基因表達量的影響
    3.4 討論
4 GhBASS5基因參與鈉離子運輸
    4.1 材料與方法
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株、質(zhì)粒和載體
        4.1.3 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 棉花中鈉鉀離子含量的測定
        4.2.2 棉花根,葉中Na~+,K~+含量隨時間的變化
        4.2.3 SBFI測定棉花根部原生質(zhì)體內(nèi)的鈉離子含量
        4.2.4 NMT測定棉花根部鈉離子流量
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 鹽脅迫下棉花不同組織鈉鉀離子含量的測定
        4.3.2 GhBASS5參與Na~+在膜上運輸
        4.3.3 NMT:沉默GhBASS5提高棉花根部對Na~+的泵出能力
    4.4 討論
5 結(jié)論與展望
參考文獻
附錄一 本試驗所用引物列表
附錄二 實驗所用主要儀器
個人簡歷
碩士期間發(fā)表學術(shù)論文與研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]非損傷微測技術(shù)在植物生理生態(tài)學研究中的應(yīng)用進展[J]. 賈代東,劉愛琴,李惠通,于洋洋,魏志超,王俊男,周麗麗.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2017(01)
[2]Prediction of VIGS efficiency by the Sfold program and its reliability analysis in Gossypium hirsutum[J]. Xiaoyang Ge,Jie Wu,Chaojun Zhang,Qianhua Wang,Yuxia Hou,Zuoren Yang,Zhaoen Yang,Zhenzhen Xu,Ye Wang,Lili Lu,Xueyan Zhang,Jinping Hua,Fuguang Li.  Science Bulletin. 2016(07)
[3]酸度對火焰光度計測定食品中鉀和鈉的影響[J]. 陳嘉勛,王志強,張方圓,舒永紅,楊金蘭.  山東化工. 2016(01)
[4]棉花葉肉原生質(zhì)體分離及目標基因瞬時表達體系的建立[J]. 李妮娜,丁林云,張志遠,郭旺珍.  作物學報. 2014(02)
[5]非損傷微測技術(shù)——揭示生命的語言[J]. 楊明.  生命世界. 2012(12)
[6]植物耐鹽相關(guān)基因及其耐鹽機制研究進展[J]. 單雷,趙雙宜,夏光敏.  分子植物育種. 2006(01)



本文編號：3728761