糖蛋白酶（Glycoprotease,Gcp）及其同源蛋白是一類(lèi)存在于細(xì)菌、古菌和真核生物細(xì)胞內(nèi)的保守蛋白,在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用。YgjD是細(xì)菌細(xì)胞中的一種糖蛋白酶,是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境和生存所必需的蛋白之一。最近發(fā)現(xiàn)YgjD與細(xì)胞內(nèi)的另外2種蛋白YjeE和YeaZ形成復(fù)合物,在細(xì)胞內(nèi)N~6-蘇氨酰氨甲酰腺苷酸-tRNA（tRNA N~6-threonylcarbamoyladenosine）合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文對(duì)哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的YgjD蛋白進(jìn)行了表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,利用定點(diǎn)突變研究了YgjD蛋白的酶活性位點(diǎn),進(jìn)行了YgjD重組蛋白的促細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)胞復(fù)蘇研究,主要研究結(jié)果如下:將含哈維氏弧菌ygjD基因的重組質(zhì)粒pET-28a-ygjD在大腸桿菌進(jìn)行了高效表達(dá),用Ni親和層析柱純化獲得YgjD重組蛋白,分別以牛血清白蛋白、ATEE、BTEE和BAPNA為底物測(cè)定了重組YgjD的蛋白水解酶活性,發(fā)現(xiàn)YgjD對(duì)牛血清白蛋白沒(méi)有明顯水解作用,但對(duì)ATEE、BTEE和BAPNA有明顯水解活性,酶的比活力分別為59000 U/mg、53700 U/mg和810... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 哈維氏弧菌概述
    1.2 細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)
        1.2.1 VBNC狀態(tài)細(xì)菌形成及其影響
        1.2.2 VBNC狀態(tài)細(xì)菌檢測(cè)及其可培養(yǎng)化
        1.2.3 復(fù)蘇促進(jìn)因子(Rpf)
    1.3 糖蛋白酶Gcp與 YgjD蛋白簡(jiǎn)述
        1.3.1 糖蛋白酶(Gcp)簡(jiǎn)述
        1.3.2 YgjD蛋白簡(jiǎn)述
    1.4 本課題研究意義及目的
第2章 哈維氏弧菌YgjD蛋白純化、酶活與性質(zhì)研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器
        2.1.3 哈維氏弧菌ygjD基因表達(dá)及蛋白純化
        2.1.4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)
        2.1.5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
        2.1.6 YgjD蛋白酶活性測(cè)定
        2.1.7 YgjD蛋白酶活性影響因素
        2.1.8 重組YgjD對(duì)牛血清白蛋白水解能力研究
        2.1.9 SDS-PAGE技術(shù)分析YgjD與 YeaZ蛋白體外作用
        2.1.10 酵母雙雜交技術(shù)分析YgjD與 YeaZ蛋白體內(nèi)作用
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 YgjD重組蛋白的純化及SDS-PAGE鑒定
        2.2.2 YgjD重組蛋白的酶活性
        2.2.3 YgjD蛋白酶活性影響因素
        2.2.4 YgjD重組蛋白對(duì)牛血清白蛋白水解作用
        2.2.5 SDS-PAGE技術(shù)分析YgjD與 YeaZ蛋白體外作用
        2.2.6 酵母雙雜交技術(shù)分析YgjD與 YeaZ體內(nèi)作用
    2.3 討論
第3章 ygjD基因定點(diǎn)突變體構(gòu)建、表達(dá)及性質(zhì)研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑與儀器
        3.1.3 ygjD基因突變構(gòu)建
        3.1.4 突變體表達(dá)質(zhì)粒的酶切與序列鑒定
        3.1.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.1.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與抽提
        3.1.7 YgjD突變蛋白表達(dá)與純化
        3.1.8 純化的YgjD突變蛋白濃度測(cè)定
        3.1.9 純化的YgjD突變蛋白蛋白酶活性測(cè)定
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 YgjD突變蛋白表達(dá)及純化
        3.2.2 純化的YgjD突變體蛋白的濃度
        3.2.3 純化的YgjD突變體蛋白酶活性
    3.3 討論
第4章 YgjD及突變蛋白的促生長(zhǎng)和促?gòu)?fù)蘇作用研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌株與培養(yǎng)基
        4.1.2 主要試劑與儀器
        4.1.3 重組蛋白YgjD對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的促生長(zhǎng)作用
        4.1.4 重組蛋白YgjD對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的促生長(zhǎng)作用
        4.1.5 低溫條件下YgjD蛋白對(duì)哈維氏弧菌SF-1 的促生長(zhǎng)作用
        4.1.6 YgjD及突變蛋白對(duì)哈維氏弧菌SF-1 生長(zhǎng)促進(jìn)作用
        4.1.7 重組蛋白YgjD對(duì) VBNC狀態(tài)哈維氏弧菌SF-1 的復(fù)蘇作用
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 重組蛋白YgjD對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的促生長(zhǎng)作用
        4.2.2 重組蛋白YgjD對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的促生長(zhǎng)作用
        4.2.3 重組蛋白YgjD對(duì)低溫培養(yǎng)的哈維氏弧菌SF-1 的促生長(zhǎng)作用
        4.2.4 YgjD及突變體蛋白對(duì)哈維氏弧菌SF-1 促生長(zhǎng)作用
        4.2.5 重組蛋白YgjD對(duì) VBNC狀態(tài)的哈維氏弧菌SF-1的復(fù)蘇作用
    4.3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3728014