本研究從發(fā)病黃顙魚體內(nèi)分離出一株病原菌,命名為GD1609211。通過生理生化特征、染色鏡檢以及16S rRNA基因序列分析等方法,確定GD1609211為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda E.tarda）。通過構(gòu)建E.tarda-EvpC原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達,并制備該蛋白的多克隆抗體,從而對表達蛋白抗體介導(dǎo)的免疫熒光檢測人工感染E.tarda后EvpC基因在黃顙魚體內(nèi)的表達時相與蛋白定位分析,以探討EvpC基因功能,為深入了解T6SS致病機理提供重要理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:1.采集患病黃顙魚病料,其主要癥狀為下頜出血,肛門紅腫,頭部皮膚破潰以及肝臟出血腫脹。從發(fā)病黃顙魚的肝臟以及腎臟內(nèi)分離純化得到一株病原菌,命名為G D1609211。表型、生理生化以及16S rRNA引物測序等方法鑒定,結(jié)果顯示:GD1609211鏡檢為革蘭氏陰性短桿狀菌,在營養(yǎng)瓊脂上形成灰白色圓形凸起、表面光滑的菌落。16S rRNA基因序列與遲緩愛德華氏菌的同源性為99%,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析顯示與遲緩愛德華氏菌聚為一支,該病原菌具有產(chǎn)酸產(chǎn)氣、產(chǎn)吲哚、產(chǎn)硫化氫,能夠在半固體瓊脂生長等遲緩愛德華... 

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 遲緩愛德華氏菌分類地位及生物學(xué)特性
    1.2 遲緩愛德華氏菌的生物學(xué)危害
    1.3 遲緩愛德華氏菌的致病機制和主要毒力因子
    1.4 遲緩愛德華氏菌檢測技術(shù)的研究進展
    1.5 免疫熒光技術(shù)在病原分布與定位研究中的應(yīng)用
    1.6 本文研究的目的與意義
第二章 遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏分析
    2.1 材料
        2.1.1 病料來源
        2.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基配制
        2.1.3 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細菌分離純化及抹片鏡檢
        2.2.2 細菌的生理、生化鑒定
        2.2.3 半數(shù)致死量的測定
        2.2.4 菌株16S rRNA基因序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.2.5 毒力基因的測定
        2.2.6 藥敏試驗
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 分離菌的形態(tài)特征
        2.3.2 病原菌的生理、生化鑒定
        2.3.3 16S rRNA基因序列的鑒定及發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.3.4 毒力基因的測定
        2.3.5 半數(shù)致死量的測定
        2.3.6 藥敏試驗
    2.4 結(jié)論與討論
第三章 遲緩愛德華氏菌EvpC基因的克隆與序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌種、質(zhì)粒、宿主菌
        3.1.2 工具酶及試劑
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計與合成
        3.2.2 EvpC基因的PCR擴增
        3.2.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
        3.2.4 PCR產(chǎn)物的回收純化
        3.2.5 感受態(tài)細胞的制備
        3.2.6 線性化表達載體pET-28b空質(zhì)粒
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 EvpC的 PCR擴增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒pET-28b-EvpC的雙酶切鑒定及PCR鑒定結(jié)果
        3.3.3 EvpC基因的測序及序列分析
    3.4 結(jié)論與討論
第四章 遲緩愛德華氏菌EvpC蛋白的誘導(dǎo)表達、抗體制備及應(yīng)用
    4.1 材料
        4.1.1 載體、菌株
        4.1.2 實驗動物
        4.1.3 儀器
        4.1.4 主要試劑及其配制
    4.2 方法
        4.2.1 EvpC基因原核表達蛋白的誘導(dǎo)表達及純化
        4.2.2 兔抗E.tarda-EvpC重組蛋白抗體的制備及純化
        4.2.3 基于兔抗EvpC重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測E.tarda感染黃顙魚組織的應(yīng)用
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 重組質(zhì)粒的表達純化
        4.3.2 EvpC蛋白多克隆抗體的制備
        4.3.3 免疫熒光檢測人工感染遲緩愛德華氏菌黃顙魚組織EvpC基因編碼蛋白方法的建立與優(yōu)化
    4.4 結(jié)論與討論
        4.4.1 遲緩愛德華氏菌EvpC基因的表達純化
        4.4.2 兔抗重組蛋白pET-28b-EvpC抗體IgG的制備與純化
        4.4.3 人工感染E.tarda后 EvpC基因在黃顙魚組織蛋白表達時相、侵染過程與定位分布
全文總結(jié)
參考文獻
攻讀學(xué)位期間發(fā)表和錄用的論文
致謝
附錄


【參考文獻】：
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本文編號：3722758