采用RT-PCR方法從黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因（manA）cDNA,按照畢赤酵母密碼子優(yōu)化序列后,構(gòu)建至畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位點之間,并與醇氧化酶強(qiáng)啟動子序列和α因子分泌肽信號序列融合。構(gòu)建好的載體進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化,提取大量質(zhì)粒并用Sac I線性化后進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化,篩選鑒定獲得酵母轉(zhuǎn)化子。重組菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)24 h后,經(jīng)甲醇誘導(dǎo),取發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測到預(yù)期分子量大小的目標(biāo)蛋白帶,β-甘露聚糖酶最高酶活為125.78 IU/mL,酶的比活力為188.86 IU/mg。結(jié)果表明β-甘露聚糖酶基因已在畢赤酵母中成功表達(dá)并能有效分泌到細(xì)胞外。 

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 質(zhì)粒、菌株、培養(yǎng)基、酶和主要試劑
    1.2 試驗方法
        1.2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶克隆
        1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.3 重組表達(dá)載體LiAc法轉(zhuǎn)入畢赤酵母
        1.2.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定與活性篩選
        1.2.5 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化與SDS-PAGE電泳
            1) 誘導(dǎo)表達(dá):
            2) 分離純化與SDS-PAGE電泳:
        1.2.6 重組β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌酶活檢測
2 結(jié)果與分析
    2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及檢測
    2.2 酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/α-manA的構(gòu)建與鑒定
    2.3 陽性克隆PCR與篩選結(jié)果
    2.4 β-甘露聚糖酶基因的在工程菌中的表達(dá)
        2.4.1 重組酶蛋白的SDS-PAGE檢測
        2.4.2 重組表達(dá)菌株酶活檢測
    2.5 討 論
3 結(jié) 論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]嗜熱菌來源新型β-甘露聚糖酶基因異源表達(dá)及飼用價值初探[D]. 嚴(yán)琳.西南民族大學(xué) 2019
[2]黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備β-甘露聚糖酶及其分離純化[D]. 張曉燕.南京林業(yè)大學(xué) 2014
[3]黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶基因克隆與表達(dá)的研究[D]. 趙順閣.江南大學(xué) 2012



本文編號：3721615