目的:CRISPR-Cas9自從2012年被研究開發(fā)利用以來,已被應(yīng)于多種領(lǐng)域,包括各種生物體的基因組編輯或者基因表達(dá)調(diào)控。與此同時,過繼性免疫治療也在治療腫瘤的試驗中取得了令人滿意的效果,人們正在努力通過對T細(xì)胞的基因編輯,開發(fā)以嵌合抗原受體（chimericantigenreceptor,CAR）T為代表的更有效的T細(xì)胞,以提高其反應(yīng)率和耐久性。而以CTLA-4、PD-1為代表的免疫檢查點分子被發(fā)現(xiàn)能夠作為免疫細(xì)胞上的抑制性受體,與對應(yīng)的配體結(jié)合,并導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭,成為細(xì)胞免疫治療的障礙。因此,本文利用CRISPR-Cas9技術(shù)和一系列針對檢查點基因的sgRNA質(zhì)粒,嘗試在原代T細(xì)胞中永久地沉默這些檢查點基因;并嘗試結(jié)合CD133 CAR,探索當(dāng)將檢查點阻斷與CAR聯(lián)合使用時會對T細(xì)胞產(chǎn)生怎樣的功能性影響。方法:我們設(shè)計并制備了包括靶向CTLA-4、TIM-3、2B4、LAG-3等sgRNA,與Cas9共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系后對靶向區(qū)域進行T7EN1檢測和T-A克隆測序,篩選出效率最高的sgRNA。通過分子克隆將高效靶向PD-1與TIM-3的sgRNA制作成多個U6啟動子串聯(lián)的sgR... 

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

PD-1,CTLA-4/CD28與其配體相互作用示意圖

CTLA-4sgRNA細(xì)助系臉證田(a)所選4個sEttNA的nm海切效果圖，以及將3與a紐合在一起時的切割效果

PD-1與TIM-3聯(lián)合sgRN^細(xì)胞系驗證圖


本文編號：3704976