卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）是中國和亞太地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖物種之一,具有生長速度快,經(jīng)濟價值高,適合網(wǎng)箱養(yǎng)殖等優(yōu)點。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,抗生素的用量也逐漸增大,不僅污染環(huán)境,還會導致病原體產(chǎn)生抗藥性�？咕囊志鷻C理與抗生素不同,不易產(chǎn)生抗藥性,是抗生素的潛在替代物,篩選相關(guān)的抗菌肽基因可以用于培育優(yōu)良品種。為了研究卵形鯧鲹抗菌肽基因功能及調(diào)控機制,本研究擴增了LEAP-2和NK-lysin基因cDNA全長序列,通過生物信息學分析了基因的結(jié)構(gòu)特征,用其編碼的氨基酸序列與其他物種進行多重比對,構(gòu)建進化樹。經(jīng)美人魚發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）刺激卵形鯧鲹后,利用實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分析LEAP-2和NK-lysin基因的組織差異表達及組織分布。克隆了基因的成熟肽片段,構(gòu)建原核表達載體,并成功在體外表達。擴增了LEAP-2和NK-lysin基因啟動子序列,通過構(gòu)建熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒檢測活性,篩選核心啟動子。利用PCR介導的定點突變技術(shù),構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變體,通過構(gòu)建熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒檢測活性,篩選出主要轉(zhuǎn)錄因... 

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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英文摘要
第一章 引言
    1.1 卵形鯧鲹簡介
    1.2 魚類免疫系統(tǒng)
    1.3 抗菌肽的研究進展
        1.3.1 魚類LEAP-2 研究進展
        1.3.2 魚類NK-lysin研究進展
    1.4 抗菌肽表達調(diào)控機制
    1.5 研究目的及意義
第二章 卵形鯧鲹LEAP-2 和NK-lysin基因的表達差異分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗用魚及菌種
        2.1.2 主要儀器及試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 組織樣品采集
        2.2.2 總RNA提取
        2.2.3 cDNA模板合成
        2.2.4 基因序列生物信息學分析
        2.2.5 實時熒光定量PCR
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 LEAP-2 基因生物信息學分析
        2.3.2 NK-lysin基因生物信息學分析
        2.3.3 LEAP-2和NK-lysin組織差異表達
        2.3.4 美人魚發(fā)光桿菌刺激表達分析
    2.4 討論
第三章 卵形鯧鲹LEAP-2和NK-lysin原核表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗用魚
        3.1.2 主要試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 樣品采集
        3.2.2 RNA提取
        3.2.3 cDNA第一條鏈的合成
        3.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.5 pET32a/mLEAP-2 蛋白表達和純化
        3.2.6 pET32a/mLEAP-2 蛋白Western blot檢測
        3.2.7 pET32a/mLEAP-2 蛋白抑菌活性檢測
        3.2.8 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白表達和純化
        3.2.9 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白Western blot檢測
        3.2.10 PGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白抑菌活性檢測
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 pET32a/mLEAP-2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 pET32a/mLEAP-2 蛋白誘導表達
        3.3.3 pET32a/mLEAP-2 蛋白的純化
        3.3.4 pET32a/mLEAP-2 蛋白Western blot檢測
        3.3.5 pET32a/mLEAP-2 蛋白抑菌活性檢測
        3.3.6 pGEX-6P-1/NK-lysin重組質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.7 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白誘導表達
        3.3.8 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白的純化及復性
        3.3.9 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白Western blot
        3.3.10 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白抑菌圈檢測
        3.3.11 pGEX-6P-1/mNK-lysin蛋白最小抑菌活性檢測
    3.4 討論
第四章 卵形鯧鲹LEAP-2 和NK-lysin基因啟動子分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1.實驗用細胞系
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 DNA的提取
        4.2.2 啟動子生物信息學分析
        4.2.3 啟動子序列擴增
        4.2.4 啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.5 細胞轉(zhuǎn)染
        4.2.6 雙熒光素酶檢測
        4.2.7 轉(zhuǎn)錄因子點突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.8 細胞轉(zhuǎn)染
        4.2.9 雙熒光素酶檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 LEAP-2 啟動子序列分析
        4.3.2 LEAP-2 啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 LEAP-2 啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的活性測定
        4.3.4 LEAP-2 啟動子轉(zhuǎn)錄因子突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.5 LEAP-2 啟動子突變轉(zhuǎn)錄因子活性檢測
        4.3.6 NK-lysin啟動子序列分析
        4.3.7 NK-lysin啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.8 NK-lysin啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的活性檢測
        4.3.9 NK-lysin啟動子轉(zhuǎn)錄因子突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.10 NK-lysin啟動子轉(zhuǎn)錄因子突變質(zhì)粒的活性檢測
    4.4 討論
結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]虹鱒免疫誘導型基因Cathelicidin2啟動子功能分析[J]. 趙紫霞,許建,江炎亮,白慶利,蔣立坤,陳葆華,徐鵬.  漁業(yè)科學進展. 2018(04)
[2]魚類免疫應答機制研究進展[J]. 白姍姍,賈智英,石連玉.  水產(chǎn)學雜志. 2017(04)
[3]草魚NK-lysin基因的克隆、原核表達與活性分析[J]. 王改玲,王明成,李傳鳳,潘磊,劉盼婷.  水產(chǎn)學報. 2017(10)
[4]斑點叉尾LEAP2成熟肽在畢赤酵母中的表達及其抑菌活性[J]. 孫立人,陶妍,高北.  上海海洋大學學報. 2017(01)
[5]團頭魴白細胞介素6基因啟動子報告載體的構(gòu)建及活性分析[J]. 扶曉琴,丁祝進,饒友亮,王衛(wèi)民,劉紅.  華中農(nóng)業(yè)大學學報. 2016(01)
[6]大黃魚肝表達抗菌肽2基因的克隆和原核表達[J]. 蔡燦,薛良義,孫愛飛.  生物學雜志. 2012(04)
[7]斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝臟表達的抗菌肽-2（LEAP-2）在E.coli中的融合表達[J]. 張虹,陶妍.  上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版). 2010(01)

碩士論文
[1]大彈涂魚抗菌肽hepcidin基因的分子克隆與表達研究[D]. 潘燕秋.深圳大學 2016
[2]半滑舌鰨三個免疫相關(guān)基因克隆、表達及CD40啟動子甲基化初步分析[D]. 位戰(zhàn)飛.上海海洋大學 2016



本文編號：3702842