本論文通過Sanger測(cè)序方法檢驗(yàn)肝癌細(xì)胞系HepG2和HuH7中PTEN基因突變情況。結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞中包含野生型PTEN基因序列,HuH7細(xì)胞中檢測(cè)到PTEN基因發(fā)生突變,因此選擇肝癌細(xì)胞系HepG2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用Western Blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中PTEN蛋白和肝癌腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白AFP的表達(dá)水平,結(jié)果顯示兩者的蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性。NGF是最早開始研究也是研究最清楚的神經(jīng)營養(yǎng)因子,近年來實(shí)驗(yàn)研究表明,NGF參與到腫瘤生長、分化、血管形成以及轉(zhuǎn)移的過程中,在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。為了進(jìn)一步探索NGF在肝癌細(xì)胞中的機(jī)制機(jī)理,本研究利用NGF處理野生型肝癌細(xì)胞HepG2和PTEN基因敲除的HepG2細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡以及周期變化。結(jié)果顯示,NGF能夠有效抑制野生型HepG2細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡并同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)G0/G1周期阻滯,對(duì)于PTEN基因敲除的HepG2細(xì)胞,NGF對(duì)其增殖、凋亡和周期沒有顯著性作用。為了進(jìn)一步探索肝癌細(xì)胞中PTEN蛋白和AFP蛋白的負(fù)相關(guān)作用,使用EGF、ATRA和NGF分別處理HepG2細(xì)胞,qRT-PC... 

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 肝癌
        1.2.1 肝癌致病因素
            1.2.1.1 肝炎病毒與肝癌
            1.2.1.2 代謝與肝癌
        1.2.2 肝癌信號(hào)通路
            1.2.2.1 YAP
            1.2.2.2 PI3K/Akt/mT0R
            1.2.2.3 ANXA3/JNK
            1.2.2.4 NANOG
        1.2.3 HCC診斷中的肝癌標(biāo)志物
            1.2.3.1 甲胎蛋白異質(zhì)體3
            1.2.3.2 鱗狀細(xì)胞癌抗原
            1.2.3.3 脫-γ-羧基凝血酶原
            1.2.3.4 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
            1.2.3.5 高爾基體糖蛋白73
            1.2.3.6 血管內(nèi)皮生長因子
        1.2.4 HCC肝癌治療相關(guān)靶點(diǎn)
            1.2.4.1 抗體療法
            1.2.4.2 遺傳學(xué)治療
            1.2.4.3 HCSC小生態(tài)環(huán)境靶向治療
            1.2.4.4 分子靶向治療
        1.2.5 肝癌治療
            1.2.5.1 肝切除術(shù)
            1.2.5.2 肝移植
            1.2.5.3 介入治療
            1.2.5.4 消融治療
            1.2.5.5 放射治療
            1.2.5.6 系統(tǒng)化療
            1.2.5.7 靶向治療
            1.2.5.8 免疫治療和基因治療
            1.2.5.9 中醫(yī)治療
    1.3 抑癌基因PTEN基因及PI3K/Akt信號(hào)通路
        1.3.1 抑癌基因PTEN基因
        1.3.2 PI3K/Akt信號(hào)通路
    1.4 CRISPR/Cas基因編輯
        1.4.1 ZFNs技術(shù)
        1.4.2 TALENs技術(shù)
        1.4.3 CRISPR/Cas技術(shù)
    1.5 本研究的主要內(nèi)容和意義
        1.5.1 研究主要內(nèi)容
        1.5.2 研究意義
        1.5.3 設(shè)計(jì)路線
2 NGF抑制HepG2細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)溶液
    2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.4.2 細(xì)胞傳代
        2.4.3 WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)
            2.4.3.1 WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)原理
            2.4.3.2 WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟
        2.4.4 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)
            2.4.4.1 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)原理
            2.4.4.2 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟
        2.4.5 細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟
        2.4.6 CRISPR/Cas9基因編輯敲除PTEN基因
    2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.5.1 細(xì)胞增殖
        2.5.2 細(xì)胞凋亡
        2.5.3 細(xì)胞周期
    2.6 小結(jié)
3 Cas9蛋白的表達(dá)與純化
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌種及質(zhì)粒
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)溶液
    3.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        3.4.1 大腸桿菌BL-21(DE3)感受態(tài)的制備
        3.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌株
        3.4.3 Cas9蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        3.4.4 表達(dá)產(chǎn)物蛋白分析
        3.4.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
        3.4.6 過表達(dá)蛋白
        3.4.7 鎳柱親和純化
        3.4.8 透析
        3.4.9 超濾濃縮
    3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.6 小結(jié)
4 肝癌細(xì)胞HepG2中PTEN基因作用以及信號(hào)通路
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.3 主要溶液
    4.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    4.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        4.4.1 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
        4.4.2 RNA提取
        4.4.3 快速反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
        4.4.4 SYBR Green熒光定量預(yù)混試劑qRT-PCR
    4.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.5.1 肝癌細(xì)胞序列比對(duì)
        4.5.2 EGF處理HepG2細(xì)胞
        4.5.3 全反式維甲酸ATRA處理細(xì)胞
        4.5.4 NGF處理HepG2細(xì)胞
        4.5.5 Akt抑制劑處理細(xì)胞
        4.5.6 CRISPR/Cas9敲除PTEN基因
        4.5.7 細(xì)胞通路
    4.6 小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者和導(dǎo)師簡(jiǎn)介
附件


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3688457