肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin,Mstn）基因失活可引起哺乳動(dòng)物的肌肉增生,但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚,且缺乏可靠的試驗(yàn)材料驗(yàn)證Mstn相關(guān)分子通路的變化。本研究所用PK3108細(xì)胞系是在野生型PK15細(xì)胞系的基礎(chǔ)上成功靶向敲除一條等位基因,在其靶位點(diǎn)敲入標(biāo)記基因,敲除了204bp的外顯子3序列,LoxP錨定在其標(biāo)記基因兩側(cè)。利用Cre/LoxP重組酶刪除系統(tǒng)刪除插入PK3108Mstn靶位點(diǎn)的標(biāo)記,借助流式細(xì)胞儀和熒光蛋白甄別得到無(wú)標(biāo)記的過(guò)渡型細(xì)胞系PK3108-2。將Cas9/sgRNA表達(dá)載體和供體DNA共轉(zhuǎn)染PK3108-2,借助G418抗性篩選和倒置熒光顯微鏡挑選出僅帶陽(yáng)性標(biāo)記的克隆L18,對(duì)其基因組進(jìn)行PCR產(chǎn)物凝膠電泳與PCR產(chǎn)物測(cè)序,證明克隆L18在預(yù)設(shè)位點(diǎn)發(fā)生同源重組;對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)表明,Mstn被成功地敲除失活。綜上結(jié)果證明,本研究實(shí)現(xiàn)了雙等位基因的精準(zhǔn)敲除,構(gòu)建了Mstn雙敲除梯度回復(fù)表達(dá)細(xì)胞系。本研究為揭示Mstn的作用機(jī)制提供理想的實(shí)驗(yàn)材料,也為雙等位基因的敲除提供了可借鑒的技術(shù)路線。 

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 Cas9/sgRNA表達(dá)載體和供體DNA的構(gòu)建
    1.3 PK3108-2和L18細(xì)胞系的構(gòu)建
    1.4 PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件
        1.4.1 PCR引物設(shè)計(jì)
        1.4.2 PCR條件
    1.5 Western印跡
2 結(jié)果
    2.1 Cas9/sgRNA和p Turbo-Cre及供體DNA載體的鑒定
    2.2 L18發(fā)生同源重組基因組左右結(jié)合部序列分析
    2.3 PK3108-2與L18的熒光標(biāo)記鑒定
    2.4 Mstn不同基因型的凝膠電泳及Western印跡
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建豬肌抑素基因敲除細(xì)胞系[J]. 綦世金,華再東,劉西梅,華文君,鄭新民,陳祥,李太山,陳建武,李奎,唐中林,畢延震,陳彬.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2016(10)
[2]Cre-LoxP重組系統(tǒng)刪除內(nèi)源性選擇標(biāo)記基因的效能評(píng)價(jià)[J]. 王志蕊,劉西梅,周荊榮,鄭新民,魏慶信,董發(fā)明,畢延震.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2014(02)
[3]肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）的研究進(jìn)展[J]. 耿紅紅,王政.  畜牧與飼料科學(xué). 2012(09)
[4]水通道蛋白5基因敲除純合子小鼠的獲取[J]. 王桂芳,董春玲,肖奎,孫加源,陳智鴻,白春學(xué).  第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2007(11)



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