漁用疫苗作為替代抗生素和化學(xué)藥物進(jìn)行魚類細(xì)菌性疾病防治更為安全有效的防治方法,得到了世界各國的廣泛重視。多聯(lián)疫苗因其可預(yù)防多種疾病、減少接種次數(shù)、簡化免疫程序等特點(diǎn),已成為當(dāng)今世界疫苗的研究和發(fā)展方向。鮰愛德華菌（Edwardsiella ictaluri）和魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）作為近年來斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖頻發(fā)的兩種細(xì)菌性疾病病原,給我國斑點(diǎn)叉尾鮰乃至整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重危害。本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF為研究對(duì)象,在對(duì)其進(jìn)行分子克隆、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)和免疫原性分析基礎(chǔ)上初步研究其作為疫苗候選目的抗原的潛力。通過添加多肽Linker接頭序列、酶切連接、融合基因技術(shù)等分子生物學(xué)手段構(gòu)建二聯(lián)融合基因N2-F,通過分子克隆和原核表達(dá)制備二聯(lián)基因N2-F亞單位疫苗。此外,采用海藻酸鈉-殼聚糖等天然高分子復(fù)合物作為包被材料,研制二聯(lián)基因N2-F口服微球疫苗,分別以腹腔注射和拌飼口服方式將二聯(lián)基因N2-F亞單位疫苗和口服疫苗免疫接種斑點(diǎn)叉尾鮰,通過特異性抗體水平、非特異性免疫指標(biāo)、免疫相關(guān)... 

【文章頁數(shù)】：192 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號(hào)說明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖概況
    2 鮰愛德華氏菌研究進(jìn)展
        2.1 生物學(xué)特性
        2.2 宿主種類和范圍
        2.3 相關(guān)毒力因子研究
        2.5 鮰愛德華氏菌外膜蛋白的研究
        2.6 鮰愛德華氏菌的疫苗研究
    3 魯氏耶爾森氏菌研究進(jìn)展
        3.1 生物學(xué)特性
        3.2 宿主種類和范圍
        3.3 相關(guān)毒力因子研究
        3.4 魯氏耶爾森氏菌外膜蛋白研究
        3.5 魯氏耶爾森氏菌疫苗研究
    4 漁用疫苗研究進(jìn)展
        4.1 漁用疫苗的發(fā)展歷程
        4.2 漁用疫苗的種類
        4.3 漁用疫苗的免疫方式
    5 漁用口服疫苗載體研究
        5.1 微囊和微球載體
        5.2 減毒細(xì)菌載體
        5.3 生物被膜載體
        5.4 生物載體疫苗
    6 本研究的目的和意義
第二章 鮰愛德華氏菌OmpN2 與魯氏耶爾森氏菌OmpF基因的分子克隆與生物信息學(xué)分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2 菌株培養(yǎng)、DNA提取與PCR擴(kuò)增
        2.3 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4 重組克隆質(zhì)粒的鑒定
        2.5 核苷酸序列特征分析
        2.6 氨基酸序列特征分析
    3 結(jié)果
        3.1 目的基因的擴(kuò)增和T克隆鑒定
        3.2 核苷酸序列特征分析
        3.3 氨基酸序列特征分析
        3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比對(duì)
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 OmpN2與OmpF的原核表達(dá)與免疫原性分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 菌株和質(zhì)粒
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2 菌株培養(yǎng)、DNA提取與PCR擴(kuò)增
        2.3 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4 重組克隆質(zhì)粒的鑒定
        2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        2.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.8 重組蛋白的大量制備及純化
        2.9 兔抗重組蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗體的制備與純化
        2.10 Western blotting分析
        2.11 目的蛋白在細(xì)菌表面分布驗(yàn)證
    3 結(jié)果
        3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.2 重組蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表達(dá)及純化
        3.3 重組蛋白的免疫原性分析
        3.4 目的蛋白在細(xì)菌表面的分布
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 二聯(lián)融合基因N2-F的構(gòu)建,分子克隆,原核表達(dá)與免疫原性分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 菌株和質(zhì)粒
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 Linker序列選擇與引物設(shè)計(jì)
        2.2 重組克隆質(zhì)粒T-N2-linker和 T-linker-F的構(gòu)建與鑒定
        2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒P-N2-linker的構(gòu)建與鑒定
        2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒P-N2-linker-F的構(gòu)建與鑒定
        2.5 融合蛋白N2-F的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗體的制備與純化
        2.7 融合蛋白N2-F免疫原性檢測
    3 結(jié)果
        3.1 N2-linker與 linker-F的 PCR擴(kuò)增
        3.2 重組克隆質(zhì)粒T-N2-linker和 T-linlker-F的構(gòu)建與鑒定
        3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒P-N2-linker的構(gòu)建與鑒定
        3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒P-N2-Linker-F的構(gòu)建與鑒定
        3.5 融合蛋白N2-F的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析
    4 討論
    5 小結(jié)
第五章 二聯(lián)基因N2-F亞單位疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰免疫效果分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 疫苗、菌株與質(zhì)粒
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)菌復(fù)壯
        2.2 亞單位疫苗制備
        2.3 免疫程序
        2.4 收集血清
        2.5 血清免疫相關(guān)指標(biāo)檢測
        2.6 攻毒試驗(yàn)及相對(duì)保護(hù)率檢測
        2.7 免疫相關(guān)基因表達(dá)分析
        2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 血清抗體水平檢測
        3.2 血清溶菌酶活性檢測
        3.3 血清補(bǔ)體C3 活性檢測
        3.4 血清總蛋白含量檢測
        3.5 血清SOD活性檢測
        3.6 免疫相關(guān)基因表達(dá)分析
        3.7 攻毒試驗(yàn)及相對(duì)保護(hù)率檢測
    4 討論
    5 小結(jié)
第六章 二聯(lián)基因口服微球疫苗的制備、條件優(yōu)化及理化特性分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 蛋白與主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 海藻酸鈉-殼聚糖復(fù)合微球制備流程
        2.2 包封率和載藥率測定
        2.3 單因素試驗(yàn)
        2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)
        2.5 口服微球疫苗的理化特性分析
        2.6 口服微球疫苗的抗原性檢測
        2.7 口服微球疫苗的安全性檢測
    3 結(jié)果
        3.1 單因素試驗(yàn)
        3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
        3.3 響應(yīng)面分析及結(jié)果驗(yàn)證
        3.4 口服微球疫苗的理化特性分析
        3.5 口服微球疫苗的抗原性檢測
        3.6 口服微球疫苗的安全性檢測
    4 討論
    5 小結(jié)
第七章 二聯(lián)基因口服疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫效果分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 疫苗、菌株與質(zhì)粒
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 口服微球疫苗制備
        2.2 口服疫苗飼料制備
        2.3 免疫程序
        2.4 血清和腸粘液采集
        2.5 腸黏液免疫相關(guān)指標(biāo)檢測
        2.6 血清免疫相關(guān)指標(biāo)檢測
        2.7 攻毒試驗(yàn)及相對(duì)保護(hù)率檢測
        2.8 免疫相關(guān)基因表達(dá)分析
        2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 腸黏液免疫指標(biāo)
        3.2 血清免疫相關(guān)指標(biāo)
        3.3 免疫相關(guān)基因表達(dá)分析
        3.4 攻毒試驗(yàn)及相對(duì)保護(hù)率檢測
    4 討論
    5 小結(jié)
全文總結(jié)
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]世界斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)近況Ⅱ:中國斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)發(fā)展與展望[J]. 鐘立強(qiáng),王明華,陳校輝,張世勇,秦欽,姜虎成,邊文冀.  水產(chǎn)養(yǎng)殖. 2018(09)
[2]豬支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白OmpQ基因的克隆表達(dá)及多抗血清的制備[J]. 寧建剛,馮娜,肖敏,高翔,溫峰琴,包世俊,邢小勇,胡永浩.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(06)
[3]革蘭氏陰性菌脂多糖運(yùn)輸系統(tǒng)的構(gòu)成及作用機(jī)制[J]. 莫婷,劉馬峰,程安春.  微生物學(xué)報(bào). 2018(09)
[4]致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌外膜蛋白A對(duì)SD大鼠免疫保護(hù)作用研究[J]. 李楚楚,劉暢,梁俊容,段然,肖萌,景懷琦,邵世和,王鑫.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2018(06)
[5]水生動(dòng)物致病菌耐藥問題與抗生素漁藥的規(guī)范使用(四)[J]. 孟思妤,孟長明,陳昌福.  科學(xué)養(yǎng)魚. 2018(05)
[6]布魯氏菌外膜蛋白Omp16的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備[J]. 熊流新,黃健,張濤,李曉婷,徐梅,陳昱希,陳安林,胡永林,閔迅.  現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2018(05)
[7]不同鋁佐劑明顯增強(qiáng)布魯菌外膜蛋白31（Omp31）的免疫接種效果[J]. 卿蕊,向晴可,劉眾齊,肖非,陽帆.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2018(02)
[8]水產(chǎn)動(dòng)物口服疫苗的研究進(jìn)展[J]. 劉世旭,王慶,方珍珍,常藕琴,曾偉偉,黃志斌.  生物技術(shù)通報(bào). 2018(06)
[9]鴨源雞桿菌外膜蛋白A的原核表達(dá)及免疫保護(hù)性分析[J]. 王艷,王坤芃,王繼洋,彭志鋒,楊霞,王川慶.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2017(10)
[10]斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖病害防治[J]. 郭志文.  漁業(yè)致富指南. 2017(14)

博士論文
[1]海豚鏈球菌DX09基因組學(xué)研究及亞單位疫苗構(gòu)建與評(píng)價(jià)[D]. 王亞軍.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]靶向TLR2聯(lián)合促滲劑增加基因透皮效率的作用及機(jī)制研究[D]. 陳彬.南方醫(yī)科大學(xué) 2014
[3]MRP8和IL-1β與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的關(guān)系和分子機(jī)制研究[D]. 甘娜.中南大學(xué) 2014
[4]魚源無乳鏈球菌bca基因的克隆、表達(dá)及亞單位疫苗和核黢疫苗的研究[D]. 鄧永強(qiáng).四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[5]鴨瘟病毒UL49基因功能研究[D]. 姜龍.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[6]黃顙魚IgM分子及其表達(dá)研究[D]. 李春濤.西南大學(xué) 2012
[7]日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結(jié)合肽的親和篩選與功能鑒定[D]. 劉彥.中南大學(xué) 2011
[8]副溶血弧菌絲氨酸蛋白酶及溶血素的表達(dá)、純化、定點(diǎn)突變及弧菌多聯(lián)DNA疫苗的研制[D]. 劉瑞.中國海洋大學(xué) 2011
[9]PLGA微球/P（NIPAAm-co-AAm）水凝膠復(fù)合體系的構(gòu)建及藥物緩釋性能研究[D]. 楊桔.重慶大學(xué) 2011
[10]斑點(diǎn)叉尾鮰海豚鏈球菌病病原學(xué)、病理學(xué)和診斷方法研究[D]. 陳德芳.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011

碩士論文
[1]斑點(diǎn)叉尾鮰源海豚鏈球菌Srr蛋白海藻酸鈉—?dú)ぞ厶强诜呙绲闹苽浼懊庖咝Чu(píng)價(jià)[D]. 王興麗.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]鮰愛德華氏菌和魯氏耶爾森氏菌二聯(lián)口服疫苗制備及免疫效果評(píng)價(jià)[D]. 陽磊.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8基因的克隆、表達(dá)及疫苗佐劑效應(yīng)研究[D]. 龍波.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[4]鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）菌蛻疫苗的研究[D]. 王榮華.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[5]注射和浸泡免疫疫苗后牙鲆免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化研究[D]. 宋曉青.中國海洋大學(xué) 2014
[6]皂角苷佐劑對(duì)大菱鲆黏膜組織抗原呈遞的影響[D]. 王銳.中國海洋大學(xué) 2014
[7]海藻酸鈉/羽毛蛋白緩釋微球的制備及性能研究[D]. 羅璋.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 2014
[8]羅非魚無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）LrrG蛋白的原核表達(dá)及其免疫原性研究[D]. 陳雪.上海海洋大學(xué) 2014
[9]小鼠局灶性腦缺血再灌注模型建立及二氫楊梅素干預(yù)研究[D]. 陳永暢.廣西醫(yī)科大學(xué) 2014
[10]月季花總黃酮對(duì)大、小鼠糖尿病模型的影響[D]. 侯朝軍.河南中醫(yī)學(xué)院 2014



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