水稻是重要的單子葉模式作物,也是我國主要的糧食作物之一。水稻在生長發(fā)育中,低溫冷害是常見的問題。研究水稻耐冷性的分子生理機制對我國水稻高產(chǎn)高效生產(chǎn)和糧食安全具有重要意義。為了研究低溫在水稻中的作用機制,最直接有效的工具就是構(gòu)建水稻突變體,基因敲除是實現(xiàn)該目標的最有效方法。本研究從水稻低溫表達芯片中挑選了11個受低溫脅迫誘導表達的基因,利用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)制了8個基因的功能缺失突變體,以及3個購自RISD（Rice T-DNA Insertion Sequence Database）的T-DNA突變體,研究這些基因與耐冷性的關系,主要結(jié)果如下:1.水稻低溫響應基因的篩選:根據(jù)日本晴幼苗低溫芯片基因表達譜篩選出11個低溫響應基因（Metall、UL、WRKY45、WI12、ADT、RBP、OS2、POT、PRP、CP12和RCI2-6）。qRT-PCR檢測了這11個基因在4℃條件下誘導表達水平,發(fā)現(xiàn)PRP基因的表達受誘導最為顯著;WRKY45和WI12基因在4℃誘導表達也明顯;ADT、RBP、OS2和POT基因受低溫誘導水平較低;而Metall、UL、CP12和RCI2-6基因... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫名詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻綜述
        1.2.1 低溫對植物的影響
        1.2.2 植物感受低溫的機制
        1.2.3 脅迫信號轉(zhuǎn)導
        1.2.4 與冷有關的調(diào)控基因與功能基因研究
        1.2.5 利用基因編輯技術研究冷響應相關基因的功能
        1.2.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    1.3 研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 酶與試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 CTAB法抽提水稻DNA
        2.2.2 水稻總RNA抽提和qRT-PCR檢測基因表達量
        2.2.3 亞細胞定位
        2.2.4 CRISPR/Cas9靶位點的選擇
        2.2.5 CRISPR/Cas9多靶位點構(gòu)建
        2.2.6 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.7 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的陽性檢測
        2.2.8 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因靶位點鑒定
        2.2.9 比較測序
3 結(jié)果與分析
    3.1 水稻冷脅迫響應相關基因的篩選
        3.1.1 水稻冷響應相關基因在水稻幼苗4℃下的誘導表達
        3.1.2 水稻冷響應相關基因T-DNA突變體分析
    3.2 Metall、UL和WRKY45蛋白的亞細胞定位
        3.2.1 Metall、UL和WRKY45亞細胞定位載體構(gòu)建
        3.2.2 Metall、UL和WRKY45蛋白在水稻原生質(zhì)體中的亞細胞定位
    3.3 Metall、UL和WRKY45純合突變體與DJ的農(nóng)藝性狀考察
    3.4 Metall、UL和WRKY45T-DNA純合突變體的耐冷性鑒定
        3.4.1 MetallT-DNA純合突變體的耐冷性鑒定
        3.4.2 UL和WRKY45T-DNA純合突變體的耐冷性鑒定
        3.4.3 T-DNA純合突變體與野生型DJ 4℃處理前后的表達分析
    3.5 利用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)建冷相關基因缺失突變體
        3.5.1 構(gòu)建CRISPR/Cas9載體時靶位點的選擇
        3.5.2 構(gòu)建CRISPR/Cas9雙靶位點載體
        3.5.3 CRISPR/Cas9功能缺失突變體植株的獲得
    3.6 冷響應相關基因的編輯位點檢測
        3.6.1 WI12基因的編輯位點檢測
        3.6.2 RBP基因的編輯位點檢測
        3.6.3 OS2基因的編輯位點檢測
        3.6.4 POT基因的編輯位點檢測
        3.6.5 PRP基因的編輯位點檢測
        3.6.6 ADT基因的編輯位點檢測
        3.6.7 CP12和RCI2-6基因雙突變體編輯位點檢測
    3.7 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株引起的突變情況和突變頻率
4 討論
    4.1 關于P-56株系特殊編輯位點的可能性分析
    4.2 如何提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在靶位點處正確的編輯效率
    4.3 運用正、反向遺傳學方法研究冷響應相關基因的功能
    4.4 提高水稻抗寒性方法的展望
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3670086