目的與背景:阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常見的慢性神經(jīng)退行性疾病,在AD病變中鈣蛋白酶過(guò)度活化,加劇AD疾病進(jìn)展。因此,抑制鈣蛋白酶對(duì)治療AD具有重要意義,但因鈣蛋白酶種類繁多,參與多種生理活動(dòng)。目前尚無(wú)特異性的鈣蛋白酶抑制劑。因此,本研究采用RNAi沉默CAPN1基因,利用Aβ25-35誘導(dǎo)的AD樣細(xì)胞模型,觀察RNAi沉默CAPN1表達(dá)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)毒性及凋亡的影響。方法:實(shí)驗(yàn)分組:1)原代胎鼠皮層神經(jīng)元+PBS;2)原代胎鼠皮層神經(jīng)元+陰性參照毒液+10μM Aβ25-35;3)原代胎鼠皮層神經(jīng)元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35;4)原代胎鼠皮層神經(jīng)元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35+2ug/ml p25;各組轉(zhuǎn)染慢病毒48小時(shí)后,再加各種藥物,再培養(yǎng)72h。CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞活力的變化情況,Annexin V-PI方法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè),Real-Time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染CAPN1 RNAi后CAPN1 mRNA的表達(dá)水平,Western blotting檢測(cè)... 

【文章來(lái)源】：南昌大學(xué)江西省211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制進(jìn)展
    1.2 阿爾茨海默病與細(xì)胞凋亡
    1.3 μ-calpain與凋亡途徑
第2章 材料與儀器
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        2.1.2 主要試劑
    2.2 主要儀器
第3章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 主要溶液配制
    3.2 CAPN1 shRNA重組慢病毒載體構(gòu)建(neuro-2a-CAPN1 shRNA)篩選
    3.3 原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)
    3.4 實(shí)驗(yàn)分組
    3.5 CCK-8法觀察各組細(xì)胞活力的變化
    3.6 Annexin V/PI流式檢測(cè)
    3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)μ-calpain的表達(dá)變化
        3.7.1 細(xì)胞總RNA提取
        3.7.2 mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
        3.7.3 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系
        3.7.4 定量PCR反應(yīng)程序
    3.8 westernblot(WB)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)
        3.8.1 提取細(xì)胞總蛋白
        3.8.2 BCA法測(cè)蛋白濃度
        3.8.3 凝膠配制
        3.8.4 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體及顯影
    3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
第4章 結(jié)果
    4.1 慢病毒介導(dǎo)μ-calpain基因有效干擾片段篩選
    4.2 RNAi沉默CAPN1基因?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞活力的影響
    4.3 RNAi沉默CAPN1基因?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞凋亡的影響
    4.4 RNAi沉默CAPN1基因?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞CAPN1mRNA表達(dá)水平的影響
    4.5 RNAi沉默CAPN1基因?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
第5章 討論
    5.1 Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及凋亡的影響
    5.2 RNAi沉默CAPN1基因?qū)β25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用及CDK5/GSK-3β通路的影響
    5.3 p25在RNAi沉默CAPN1基因中對(duì)Aβ25-35引起的CDK5/GSK-3β通路的影響
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 全文總結(jié)
    6.2 不足之處與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：本研究資助項(xiàng)目
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A possible therapeutic potential of quercetin through inhibition of μ-calpain in hypoxia induced neuronal injury:a molecular dynamics simulation study[J]. Anand Kumar Pandey,Swet Chand Shukla,Pallab Bhattacharya,Ranjana Patnaik.  Neural Regeneration Research. 2016(08)



本文編號(hào)：3629155