規(guī)律成簇的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物基因組中的重復(fù)序列,是在細(xì)菌生命進(jìn)化過程中與病毒相互對抗時(shí)出現(xiàn)的一種免疫系統(tǒng),運(yùn)用此系統(tǒng),細(xì)菌能夠從它們的染色體上切除病毒基因。近年來研究人員將CRISPR系統(tǒng)開發(fā)作為基因編輯工具已成功應(yīng)用于小鼠、人類細(xì)胞、煙草和微生物等多種模式生物中。家蠶作為一種重要的模式生物,家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是蠶業(yè)上的主要蠶病之一,嚴(yán)重制約著蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而隨著對CRISPR系統(tǒng)的深入探究發(fā)現(xiàn)CRISPR家族的新成員Cpf1,它同時(shí)具有DNA酶和RNA酶活性,使得Cpf1編輯系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理上存在著更多的優(yōu)勢。因此,迫切需要在家蠶模式生物中建立Cpf1編輯系統(tǒng),利用其優(yōu)勢高效地作用于BmNPV基因組,提高家蠶抗病毒能力。本研究首先構(gòu)建家蠶AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1編輯系統(tǒng),檢測其編輯能力;進(jìn)而構(gòu)建靶標(biāo)BmNPV ie1的敲除載體,分析敲除BmNPV ... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

基因編輯技術(shù)原理[1]

t被spacer序列相隔開。CRISPR通過spacer和靶標(biāo)基因進(jìn)行識(shí)別，儲(chǔ)存和記錄外源核酸入侵的信息。前導(dǎo)區(qū)位于CRISPR陣列前，和repeat序列相連，用于啟動(dòng)CRISPR的轉(zhuǎn)錄即前體crRNA（PrecursortranscriptRNA，pre-crRNA），而對應(yīng)的反義鏈上的pre-crRNA也會(huì)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工，形成互補(bǔ)的反式激活crRNA（TransactivatingcrRNA，tracr-RNA）[71]。Cas是位于CRISPR附近的一種雙鏈DNA核酸酶，和tracr-RNA和crRNA形成復(fù)合物，在gRNA的引導(dǎo)作用下對CRISPR識(shí)別的靶標(biāo)位點(diǎn)切割，功能和FokI類似，但不需要形成二聚體來發(fā)揮功能。圖1.2CRISPR/Cas的組成結(jié)構(gòu)圖[70]。Figure1.2CompositionofCRISPR/Cas[70].

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文4CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌抵抗外界遺傳物質(zhì)入侵的自身免疫系統(tǒng)，可以在入侵的基因組中插入新的間隔序列；當(dāng)相同的外源基因再次入侵時(shí)，會(huì)定向靶標(biāo)切割外源基因，能夠?yàn)榧?xì)菌提供特異性的免疫保護(hù)。CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制一般分三步[72]：（1）適應(yīng)階段，是cas蛋白識(shí)別獲取spacer和其下游的前間區(qū)序列鄰近基序（Protospaceradjacentmotif，PAM）序列的過程，而且各個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)的PAM也不一樣。當(dāng)外源基因入侵時(shí)，Cas蛋白識(shí)別剪切spacer并插入到leader序列和其相鄰repeat序列中間，從而組成新的spacer序列。以防相同的外源基因入侵時(shí)，能對其基因組剪切，阻斷其復(fù)制和表達(dá)。（2）表達(dá)階段，是crRNA的加工和成熟過程。leader序列啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后形成的長鏈RNA為pre-crRNA，隨后被相關(guān)Cas蛋白加工剪切成成熟的含單一spacer的crRNA，并且crRNA序列是和靶標(biāo)基因互補(bǔ)的。（3）免疫干擾，成熟的crRNA能夠和Cas蛋白等組成復(fù)合物，從而引導(dǎo)Cas蛋白對外源基因的剪切。并且不同的CRISPR系統(tǒng)的復(fù)合物也不同（圖1.3）。圖1.3CRISPR/Cas系統(tǒng)分子機(jī)制[72]。Figure1.3MolecularmechanismofCRISPR/Cassystem[72].1.2.2CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類Cas蛋白作為CRISPR相關(guān)蛋白，一般情況下每種CRISPR/Cas系統(tǒng)包含4~10個(gè)Cas基因串聯(lián)組成[73]。根據(jù)Cas基因數(shù)目和序列的不同，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為2個(gè)類型：Class1和2[74,75]。第1類CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I型標(biāo)簽基因?yàn)镃as3、

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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