發(fā)布時(shí)間：2022-02-08 19:33

　　將特定的外源基因?qū)胝婧思?xì)胞中,并整合到受體細(xì)胞基因組中得到穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù),稱為基因?qū)?它是改變生物遺傳性狀的根本途徑。目前,顯微注射是目前使用較為廣泛的基本技術(shù),它的優(yōu)勢(shì)是基因?qū)胄Ч鄬?duì)穩(wěn)定,成功率也比較高。但是,實(shí)現(xiàn)這些優(yōu)點(diǎn)需要熟練的技術(shù)人員和擁有昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器。同時(shí),在顯微鏡下通過精細(xì)的操作來避免卵母細(xì)胞的損傷和精確的控制DNA注射量來確保卵母細(xì)胞的安全都是有相當(dāng)困難的,并且只能夠一個(gè)接一個(gè)的進(jìn)行注射,處理樣品的數(shù)量有限。因此,傳統(tǒng)的將外源基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入胚胎細(xì)胞的方法已不能滿足當(dāng)前研究的要求,特別是利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯和RNA干擾進(jìn)行基因沉默等技術(shù)的進(jìn)步,也迫切的需要一種新的方法來取代傳統(tǒng)的技術(shù)方法。本研究使用聚乙烯亞胺（PEI）包裹的金納米粒子（AuNPs）負(fù)載質(zhì)粒DNA成功的構(gòu)建出了一種行之有效的基因載體系統(tǒng),在盡量減輕胚胎細(xì)胞所受傷害的同時(shí)降低了技術(shù)難度。本研究將小鼠受精卵在含有AuNPs@PEI@DNA載體復(fù)合物（APD）的KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)至囊胚形成后植入假孕母鼠體內(nèi),從而獲得轉(zhuǎn)基因后代。通過熒光觀察,證實(shí)了GFP在早期胚胎細(xì)胞中的表達(dá),并且... 

【文章來源】：阜陽(yáng)師范大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

常用于基因?qū)氲年?yáng)離子聚合物

第1章綜述6帶正電荷的氨基基團(tuán)能與DNA分子中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過靜電吸附作用相互結(jié)合。PEI具有很強(qiáng)的負(fù)載和壓縮質(zhì)粒DNA的能力，所形成的球形復(fù)合物粒徑不超過100nm，能有效的被細(xì)胞攝取內(nèi)吞，并可以使DNA逃脫胞內(nèi)溶酶體的吞噬，免受核酸酶降解，從而可以將外源基因物質(zhì)導(dǎo)入到細(xì)胞核內(nèi)并表達(dá)[61]。然而，PEI的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性都與其分子量緊密相關(guān)，高分子量的PEI在大多數(shù)哺乳細(xì)胞系中均表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，但高分子量的PEI由于表面正電荷的富集，有著較高的細(xì)胞毒性，從而限制了它的應(yīng)用[62]。另一方面，研究表明雖然低分子量的PEI細(xì)胞毒性很低，但是由于它不能有效的與DNA縮合[63]，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染效率較低[64]。1.3.1.2脂質(zhì)體(Liposomes)脂質(zhì)體是由磷脂和神經(jīng)酰胺等物質(zhì)通過自組裝制得的具有內(nèi)空腔的脂質(zhì)囊泡，其雙分子層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相同。在水中，磷脂分子親水頭端插入水中，脂質(zhì)體疏水尾端伸向空氣，攪動(dòng)后便可形成雙層脂分子的球形封閉囊泡，稱為脂質(zhì)體，直徑25~1000nm不等，如Fig1-2所示。圖1-2脂質(zhì)體的構(gòu)造示意Fig1-2Thestructureofliposomes脂質(zhì)體制備相對(duì)比較簡(jiǎn)單，親水基團(tuán)和連接基團(tuán)的多樣化使其可以同時(shí)容納疏水和親水性的物質(zhì)，可以攜帶較多的外源基因物質(zhì)導(dǎo)入各類細(xì)胞，且有著較高的轉(zhuǎn)染效率[65]。目前，部分陽(yáng)離子脂質(zhì)體已經(jīng)商業(yè)化，使用成品試劑可以穩(wěn)定的將外源基因?qū)胍恍┓N類的細(xì)胞中。但是，相比脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染較高的轉(zhuǎn)染率，其體內(nèi)轉(zhuǎn)染率則顯著降低，且毒性較高[66]。1.3.2無機(jī)納米粒子載體無機(jī)納米粒子制備相對(duì)簡(jiǎn)單、易保存，其在基因載體中的應(yīng)用已經(jīng)成為了新的研

等[73]特點(diǎn)。其中，金納米粒子（AuNp）是目前研究較為深入和廣泛的一種金屬納米材料，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和較好的生物相容性而在基因治療和生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。金納米粒子是生物惰性材料，在大多文獻(xiàn)中被認(rèn)為基本無毒[74]，而且它制備簡(jiǎn)單，粒徑可控，容易通過與各種基團(tuán)的結(jié)合作用而實(shí)現(xiàn)功能化。特別是粒徑小的金納米粒子比表面積巨大，便于在其表面進(jìn)行高密度的接枝，從而徹底改變粒子的表面性質(zhì)[75]比如，可以將一定分子量的PEI接枝到金納米粒子上，從而提高其對(duì)DNA的結(jié)合力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率。圖1-3以納米金為核心包覆PEI構(gòu)建基因載體Fig1-3ThegenecarrierconsistsofgoldnanoparticlescoatedwithPEI1.3.2.4納米二氧化硅（nano-silicondioxide）納米二氧化硅，俗稱白炭黑，目前其制備技術(shù)已十分成熟，粒徑范圍一般在1-100nm之間，因小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)而具有獨(dú)特的性質(zhì)，在催化、濾光、醫(yī)藥、磁介質(zhì)等方面有著廣泛的應(yīng)用。納米二氧化硅易于進(jìn)行表面修飾而實(shí)現(xiàn)生物功能化，良好的生物相容性使其可以用于藥物遞送和基因物質(zhì)的導(dǎo)入。如使用氯硅烷或氯化鈉修飾的二氧化硅納米粒子可以用于外源基因物質(zhì)導(dǎo)入活體細(xì)胞，在無細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率[76]，并在應(yīng)用于活體小鼠實(shí)驗(yàn)中，也未發(fā)現(xiàn)組織和細(xì)胞的病態(tài)變化。納米二氧化硅因其獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)，適于作為外源基因物質(zhì)載體的同時(shí)，可以裝載熒光染料，在介導(dǎo)外源基因物質(zhì)導(dǎo)入受體細(xì)胞的同時(shí)實(shí)現(xiàn)示蹤功能[77]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體制備及體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 蔣家云,鄒孟達(dá),陳施瀚,鄧青松,譚運(yùn)華,夏峰,馬寬生.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(09)

博士論文
[1]聚乙烯亞胺修飾的無機(jī)納米粒子作為基因載體的研究[D]. 胡楚.武漢大學(xué) 2010

碩士論文
[1]生物體內(nèi)可降解的聚乙烯亞胺類基因載體的設(shè)計(jì)與應(yīng)用[D]. 匡佳.大連理工大學(xué) 2019



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