青魚是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類,但是自然和養(yǎng)殖環(huán)境的多種病原微生物對青魚的養(yǎng)殖構(gòu)成了嚴重威脅。本研究以青魚IRF5（Black carp interferon regulated factor 5,bcIRF5）為研究對象,探究了bcIRF5在宿主及宿主細胞抗病毒先天性免疫過程中發(fā)揮的作用。本研究克隆了青魚IRF5基因,并對青魚IRF5基因進行了重組表達及功能分析,取得了如下結(jié)果:1.與其他動物的IRF5同源物相比,青魚IRF5在序列和結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性,其氨基酸序列與同為鯉科魚類的草魚和斑馬魚IRF5的氨基酸序列具有極高的相似性,分別為99.6%和93.6%;而其兩個重要結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合區(qū)域（DNA banding domain,DBD）和IRF相關結(jié)構(gòu)域（Interferon association domain,IAD）則極為保守;2.實時熒光定量PCR顯示SVCV和GCRV能影響bcIRF5在不同組織中的表達,同時發(fā)現(xiàn)兩種模擬刺激物（Poly（I:C）與LPS）和SVCV與GCRV這兩種病毒也在宿主細胞MPK中影響bcIRF5的mRNA表達水平;3.蛋白質(zhì)免疫印跡顯示在EPC... 

【文章來源】：湖南師范大學湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

bcIRF5的CDS區(qū)域

青魚IRF5基因的克隆及功能初探27達沒有顯著差異外，在其他組織中bcIRF5的表達量均有顯著上升；同時，我們發(fā)現(xiàn)bcIRF5對于SVCV和GCRV刺激的應答水平存在一定差距。SVCV處理組，在腸和腎臟中能檢測到較高的bcIRF5的mRNA水平，分別為對照組（將檢測到的最小表達實驗組作為基準組，即PBS處理的腸(Intestine)）的12倍和11倍，而在心臟中則導致了其表達降低了2.2倍。而GCRV處理組則都在一定程度上上調(diào)了bcIRF5在不同組織中的表達，其中較為顯著的是在腎臟、脾臟和心臟中，分別達到了基準組的19倍、9倍、和37倍見圖3-4。以上結(jié)果說明了SVCV和GCRV對bcIRF5在不同組織中的表達有影響，即bcIRF5參與了青魚抵御SVCV和GCRV的抗病毒防御過程，同時也表明機體對這兩種病毒的抵御機制有一定差異。圖3-4：bcIRF5在青魚不同組織中的表達。對六月齡的青魚（120g左右）分別處以SVCV（2.43×106pfu每條魚）、GCRV（2.52×106pfu每條魚）和無菌PBS（對照組）腹腔注射并于26℃飼養(yǎng)。每個注射組分別隨機挑選三條魚，在注射后33h分離并收集青魚組織。將同一實驗組中分別提取自同一實驗組的三條魚的各器官的總RNA合成為cDNA模板并進行實時熒光定量PCR檢測。Fig3-4：theexpressionofbcIRF5indifferentorgansinblackcarp.Blackcarpofsixmonths(weightof120g)wasinjectedintraperitoneallywithSVCV(2.43×106pfuperfish),GCRV(2.52×106pfuperfish)orsterilePBS(controlgroup)separatelyandculturedat26°C.Threefishwererandomlyselectedfromeachinjectiongroup,andthetissueofblackcarpwasisolatedandcollectedat33hafterinjection.ThetotalRNAwhichwassynthesizedintoacDNAtemplateextractedfromeachorganofthreefishesinthesameexperimentalgroupanddetectedbyqPCR.

青魚IRF5基因的克隆及功能初探29圖3-5：MPK細胞中bcIRF5的表達。分別用不同濃度的Poly(I:C)（A）和LPS（B）或不同MOI的SVCV（C）和GCRV（D）刺激培養(yǎng)于六孔板中的青魚腎細胞（2×106個細胞每孔），在圖中所示的不同時間點收取細胞并提取其總RNA，然后再逆轉(zhuǎn)為qPCR模板后檢測bcIRF5mRNA的相對表達水平。Figure3-5:bcIRF5expressioninMPKcells.MPKcellsin6-wellplate(2×106cells/well)weretreatedwithPoly(I:C)(A)orLPS(B)atindicatedconcentrationseparately;orinfectedwithSVCV(C)orGCRV(D)atindicatedMOIseparately.CollectcellsatdifferenttimepointsandextracttheirtotalRNA,andthentherelativeexpressionlevelofbcIRF5mRNAwasdetectedafterreversingtoqPCRtemplate.3.5bcIRF5蛋白的表達為明確bcIRF5在體外培養(yǎng)的細胞系中的過表達情況，我們分別構(gòu)建了pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag。我們選取了兩種具有代表性的細胞系（EPC和HEK-293T細胞）來進行真核細胞過表達實驗。我們的結(jié)果顯示，不管是在這一常用的魚類相關研究細胞系（EPC細胞）還是在HEK293T細胞這一高效表達外源基因的哺乳動物細胞系中，bcIRF5均能成功表達。在這兩種細胞中，分別由pcDNA5/FRT/TO-Flag-bcIRF5和pcDNA5/FRT/TO-bcIRF5-Flag表達的蛋白條帶大小均為65kDa，如圖3-6。由于

【參考文獻】：
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本文編號：3600156