L-天冬氨酸β-脫羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase,EC 4.1.1.12,Asd）催化L-天冬氨酸脫去β位羧基生成L-丙氨酸,工業(yè)上用于生產(chǎn)L-丙氨酸。L-丙氨酸在食品、日化以及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用,酶法生產(chǎn)L-丙氨酸具有副產(chǎn)物少、立體選擇性強(qiáng)、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)從土壤中篩選菌株,挖掘具有高酶活力的Asd,利用大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá),對(duì)Asd酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征與分子改造后,偶聯(lián)L-天冬氨酸裂解酶,構(gòu)建了雙酶共表達(dá)的重組大腸桿菌,建立了全細(xì)胞催化富馬酸合成L-丙氨酸的工藝。主要研究結(jié)果如下:（1）成功篩選到Acinetobacter radioresistens來(lái)源L-天冬氨酸β-脫羧酶（ArAsd）并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。在富含氨基酸的土壤中篩選獲得一株具有Asd活性的菌株,菌種鑒定為Acinetobacter radioresistens。克隆獲得ArAsd基因后構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a（+）-ArAsd并在E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行異源表達(dá),在ArAsd蛋白氨基酸序列N端添加His標(biāo)簽,利用鎳柱純化成功獲得電泳純目的蛋白。采用凝... 

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L-天冬氨酸β-脫羧酶催化反應(yīng)方程式Fig.1-1ReactionrouteofL-aspartate-β-decarboxylase

組合為十二聚體時(shí)有重要作用；偏堿性的環(huán)境會(huì)造成Asd分子松散化，隨著pH值升高，酶分子逐漸解聚為二聚體，酶活逐漸降低。Lima[1]等人發(fā)現(xiàn)P.dacunhae來(lái)源Asd的活性中心位于單聚體界面，輔酶因子PLP與Lys315形成席夫堿，PLP磷酸基團(tuán)與Arg37、Tyr134（另一個(gè)亞基）、Gly174、Thr175、Ser312、Ser314、Arg323形成氫鍵，PLP吡啶氮原子與Asp286、Tyr207形成氫鍵，PLP吡啶環(huán)氧原子與Asn256、Tyr289形成氫鍵，Arg37覆蓋在催化中心表面，控制底物和產(chǎn)物的進(jìn)出。Asd單體三維結(jié)構(gòu)（PDBID:3fdd）（PDB:ProteinDataBank）如圖1-2所示。圖1-2L-天冬氨酸β-脫羧酶的三維立體結(jié)構(gòu)注：A：Asd單體三維立體結(jié)構(gòu)；B：Asd十二聚體三維立體結(jié)構(gòu)Fig.1-2TertiarystructureofL-aspartate-β-decarboxylase1.1.3L-天冬氨酸β-脫羧酶的分子改造研究酶蛋白的穩(wěn)定性決定了該酶在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用可行性。雖然Asd已被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)L-丙氨酸，但由于其在偏酸條件下穩(wěn)定性較差且底物專一性較差，Asd的轉(zhuǎn)化效率被大大限制，為提高其底物專一性及底物催化轉(zhuǎn)化效率，已有多位研究人員利用分子生物學(xué)方法對(duì)Asd進(jìn)行改造。為了探索Asd的脫羧與轉(zhuǎn)氨的差異關(guān)鍵性位點(diǎn)，Wang[9]等人通過(guò)比對(duì)多個(gè)L-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與Asd的氨基酸序列，選擇了在轉(zhuǎn)氨酶序列中保守但在脫羧酶中具有差異的Ser298、Tyr207和Pro257突變?yōu)閷?duì)應(yīng)位置的轉(zhuǎn)氨酶上的氨基酸，酶活檢測(cè)表明Ser298Arg的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白十二聚體的三維結(jié)構(gòu)解聚為脫羧酶活性幾乎完全喪失的二聚體；Tyr207His和Pro257His的突變因位于酶活中心而導(dǎo)致酶蛋白活性幾乎完全喪失，但蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。Wang[3]等人也對(duì)Asd和L-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的差異保守殘基進(jìn)行了研究，突變株F204W對(duì)底物的轉(zhuǎn)氨酶活力發(fā)生明顯增

92.3%。Asd也可以用來(lái)拆分DL-天冬氨酸生產(chǎn)D-天冬氨酸[22]。1975年，Kokai[17]利用固定化Asd來(lái)制備D-天冬氨酸，但該過(guò)程中釋放的CO2會(huì)破壞固定化柱，降低生產(chǎn)效率。1989年，Masaru[23]等對(duì)固定化反應(yīng)器進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，采用高壓柱式反應(yīng)器，提高了生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)了D-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。1.2L-丙氨酸概述1.2.1L-丙氨酸的性質(zhì)與應(yīng)用L-丙氨酸（L-Alanine，L-Ala）是最小的手性分子之一，分子式為C3H7NO2，相對(duì)分子量為89.09。熔點(diǎn)為297oC，密度為1.432g·cm-1，是一種人體非必需氨基酸。分子結(jié)構(gòu)如下圖1-3所示。圖1-3L-丙氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-3ChemicalstructureofL-alanineL-丙氨酸在醫(yī)藥、食品、日化、化工合成等方面用途十分廣泛[24]。醫(yī)藥領(lǐng)域：L-丙氨酸是制備維生素B6和L-2-氨基丙醇的中間體[25,26]。維生素B6參與人體內(nèi)氨基酸循環(huán)、氨基酸與糖原轉(zhuǎn)換等多種代謝過(guò)程，是人體必需的維生素之一，可單獨(dú)或者與其他藥物復(fù)合用于治療多種皮膚炎癥疾病[27]，維生素B6在治療貧血、白細(xì)胞減少癥、帕金森綜合癥和妊娠糖尿病等方面也有著廣泛的新用途[28,29]。L-2-氨基丙醇可用于合成左旋氧氟沙星，該藥物對(duì)細(xì)菌、支原體、衣原體有很好的消殺抑制作用，在臨床上可用于治療各種細(xì)菌性感染。同時(shí)，L-丙氨酸是可用于復(fù)合氨基酸注射液，也可用作心肌功能增強(qiáng)劑。在配制組織培養(yǎng)基和生化試劑以及肝功能檢測(cè)是，L-丙氨酸也

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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