本文關(guān)鍵詞：豆?fàn)顜Ы{蟲胰島素樣生長因子受體基因的克隆表達(dá)及互作蛋白鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豆?fàn)顜Ы{蟲是一種重要的寄生蠕蟲,其幼蟲引起的豆?fàn)钅椅豺什︷B(yǎng)兔業(yè)危害嚴(yán)重。胰島素樣生長因子受體(IGFR)作為一種重要的多功能細(xì)胞調(diào)控因子,在動物機(jī)體的細(xì)胞增殖、生長及維持正常代謝等方面發(fā)揮重要作用,可作為潛在的藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子。本研究對豆?fàn)顜Ы{蟲胰島素樣生長因子受體(Tp IGFR)基因進(jìn)行了克隆表達(dá)及互作蛋白鑒定。主要取得以下結(jié)果:1.豆?fàn)顜Ы{蟲胰島素樣生長因子受體(Tp IGFR)基因的克隆與序列分析。用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)克隆Tp IGFR基因全長c DNA序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:Tp IGFR cDNA全長5 154 bp,包含一個(gè)完整的ORF,大小約4 953 bp,編碼1 651個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量約為181.92 ku。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,TpIGFR蛋白由胞外配體結(jié)合區(qū)(LD)、跨膜區(qū)(TM)和酪氨酸蛋白激酶區(qū)(TK)組成,具有IGFR的特征結(jié)構(gòu)域。用Mega 5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,Tp IGFR與豬帶絳蟲胰島素樣生長因子受體均處于同一進(jìn)化分支。2.Tp IGFR胞外配體結(jié)合區(qū)(Tp IGFR-LD)的原核表達(dá)及組織定位。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-TpIGFR-LD,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析,重組蛋白Tp IGFR-LD以包涵體形式表達(dá),分子量大小約51.48 ku。Western blot分析表明,重組蛋白能被兔豆?fàn)钅椅豺矢腥狙寮翱笻is抗體特異識別,具有良好的反應(yīng)原性。鎳瓊脂糖凝膠純化蛋白Tp IGFR-LD,用弗氏佐劑乳化后、多點(diǎn)注射免疫家兔,免疫4次,用間接ELISA法檢測,效價(jià)達(dá)1:2.56×104。免疫組化結(jié)果表明,Tp IGFR-LD主要表達(dá)于成蟲的體壁及卵巢,預(yù)測Tp IGFR可能與蟲體攝取營養(yǎng)及生殖發(fā)育有關(guān)。3.Tp IGFR-LD和豆?fàn)顜Ы{蟲胰島素樣多肽(TpI)的真核表達(dá)。構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tp IGFR-LD和pCMV-myc-TpI,共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。間接免疫熒光分析表明,Tp IGFR-LD和Tp I均在真核細(xì)胞中成功表達(dá)。4.Tp IGFR-LD和TpI蛋白相互作用。免疫熒光共聚焦試驗(yàn)表明,發(fā)紅色熒光的pCMV-HA-Tp IGFR-LD可與發(fā)綠色熒光的p CMV-myc-Tp I共表達(dá)呈黃色熒光。免疫共沉淀(Co-IP)證實(shí)Tp IGFR-LD和Tp I均具有生物學(xué)活性,Tp IGFR-LD可識別Tp I,存在相互作用。
【關(guān)鍵詞】：豆?fàn)顜Ы{蟲 TpIGFR-LD 原核表達(dá) 組織定位 真核表達(dá) 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 摘要2-3
• SUMMARY3-5
• 英文縮略語表5-8
• 第一章 文獻(xiàn)綜述8-14
• 1.豆?fàn)顜Ы{蟲概述8-10
• 1.1 豆?fàn)顜Ы{蟲及生活史8
• 1.2 豆?fàn)钅椅豺什?/span>8-9
• 1.3 豆?fàn)顜Ы{蟲病的免疫診斷9
• 1.4 豆?fàn)顜Ы{蟲病的治療與防治9-10
• 2.胰島素樣生長因子受體概述10-13
• 2.1 胰島素樣生長因子受體及其分類10
• 2.2 胰島素樣生長因子受體的結(jié)構(gòu)10-11
• 2.3 胰島素樣生長因子受體的生物學(xué)功能11-12
• 2.4 抑制劑12-13
• 3.研究目的與意義13-14
• 第二章 TPIGFR基因的克隆與序列分析14-25
• 1.材料與方法14-18
• 1.1 蟲體、菌株及試劑14
• 1.2 主要儀器14-15
• 1.3 總RNA的提取15-16
• 1.4 cDNA合成16
• 1.5 TpIGF基因的擴(kuò)增16-17
• 1.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測17
• 1.7 克隆載體的鑒定TpIGF基因序列分析17-18
• 1.8 TpIGF基因序列分析18
• 2.結(jié)果18-23
• 2.1 總RNA的提取18
• 2.2 TpIGF基因的克隆18
• 2.3 TpIGF基因的序列分析18-23
• 2.3.1 TpIGF的理化性質(zhì)18-19
• 2.3.2 TpIGF系統(tǒng)進(jìn)化分析19-20
• 2.3.3 TpIGF二級結(jié)構(gòu)分析20-22
• 2.3.4 TpIGF結(jié)構(gòu)域分析22
• 2.3.5 TpIGF三維結(jié)構(gòu)預(yù)測22-23
• 3.討論23-25
• 第三章 TPIGFR-LD的原核表達(dá)及組織定位研究25-34
• 1.材料與方法25-28
• 1.1 載體與實(shí)驗(yàn)動物25
• 1.2 主要試劑25
• 1.3 主要儀器25
• 1.4 構(gòu)建TpIGFR-LD重組質(zhì)粒25-27
• 1.5 TpIGFR-LD的表達(dá)及Western-blotting27
• 1.6 重組蛋白的免疫組化27-28
• 1.6.1 制備抗體27
• 1.6.2 測定血清效價(jià)27-28
• 1.6.3 檢測抗體特異性28
• 1.6.4 TpIGFR-LD組織定位28
• 2.結(jié)果28-32
• 2.1 TpIGFR-LD基因的擴(kuò)增28-29
• 2.2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒29
• 2.3 TpIGFR-LD的表達(dá)Western blotting29-31
• 2.4 血清效價(jià)測定31
• 2.5 抗體的特異性檢測31-32
• 2.6 TpIGFR-LD的定位分布32
• 3.討論32-34
• 第四章 TPIGFR-LD的真核表達(dá)及蛋白互作34-43
• 1. 材料與方法34-38
• 1.1 載體和細(xì)胞34
• 1.2 主要試劑34
• 1.3 主要儀器34-35
• 1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建35-37
• 1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系的建立37-38
• 1.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞37
• 1.5.2 間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)37-38
• 1.6 重組蛋白的相互作用實(shí)驗(yàn)38
• 2. 結(jié)果38-41
• 2.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定38-39
• 2.2 重組質(zhì)粒間接熒光免疫鑒定39-40
• 2.3 重組蛋白共聚焦鑒定40
• 2.4 重組蛋白Co-IP鑒定40-41
• 3. 討論41-43
• 第五章 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 致謝48-49
• 作者簡介49-50
• 導(dǎo)師簡介50-52

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本文編號：359488