本文關鍵詞：大葉落地生根KdSAHH基因功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, SAHH)廣泛存在于生物體內,是已知的唯一能夠水解S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine, SAH)成半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的酶。SAH作為轉甲基反應的抑制劑,與S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM,體內甲基供體)的比值常用來作為衡量植物整體甲基化水平的重要指標。在該研究中,根據已知的大葉落地生根(Kalanchoe daigremontiana) KdSAHH基因序列(GenBank登錄號：KF953475),對該基因進行亞細胞定位分析、干旱表達分析以及煙草轉化,以初步鑒定KdSAHH基因的功能,為后續(xù)全面深入研究該基因提供一定的借鑒與參考。通過研究,得到如下結論：1.構建了亞細胞定位表達載體3302Y-KdSAHH,利用瞬時轉化法注射健康生長三周大小的本生煙草葉片,暗培養(yǎng)48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的表達情況,結果顯示,黃色熒光在細胞質與細胞核中均有分布,表明大葉落地生根SAHH蛋白定位于細胞質與細胞核。2.對健康生長的大葉落地生根植株進行自然干旱處理,分別在土壤相對含水量達到20%、10%、3%時的三個時間點取樣,通過半定量RT-PCR分析KdSAHH基因的表達模式,結果顯示,隨著干旱脅迫程度的加重,KdSAHH的表達量逐漸升高,表明該基因與抗旱性相關。3.構建了植物超表達載體pZH01-KdSAHH,利用農桿菌介導的葉盤法轉化野生型煙草W38,經過誘芽、生根得到煙草再生植株,對再生煙草分別進行載體HPT基因片段及目的基因KdSAHH的陽性檢測,結果顯示共獲得9株陽性植株。4.用20%的PEG6000對轉KdSAHH煙草和野生型煙草進行模擬干旱處理,分別在0h,12h和24 h取樣,測定相關生理指標。結果顯示,在PEG6000處理的24 h,兩種煙草均表現出了明顯的失水癥狀,轉KdSAHH煙草萎蔫程度較輕,上端仍有部分葉片保持挺立,而野生型煙草所有葉片均表現出明顯的失水癥狀。與野生型煙草相比,轉基因煙草葉片RWC與Chl含量下降程度較輕,兩種煙草的葉片RWC在24 h差異顯著(P0.05),Chl含量在12與24h均差異顯著(P0.05),表明在干旱脅迫下,轉基因煙草能夠保持相對穩(wěn)定的代謝。兩種煙草在干旱脅迫下產生的MDA含量均有所增加,相比之下,野生型煙草的上升程度較大,在24 h兩者差異顯著(P0.05),表明轉基因煙草膜脂過氧化程度較輕,受傷害小。兩種煙草的SOD含量與POD含量均呈明顯的上升趨勢,相比之下,野生型煙草產生了更多的SOD和POD。兩者的POD含量在12與24 h差異顯著(P0.05),SOD含量則無明顯差異。分析可能是因為轉基因煙草抗旱性增強,故而未產生較多的活性氧。
【關鍵詞】：大葉落地生根 KdSAHH 亞細胞定位 表達分析 干旱脅迫
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮寫詞10-12
• 1 引言12-24
• 1.1 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因13-16
• 1.1.1 DNA甲基化與表觀遺傳13-14
• 1.1.2 SAHH的研究概況14-16
• 1.2 大葉落地生根簡介16-18
• 1.2.1 大葉落地生根的觀賞價值16
• 1.2.2 大葉落地生根的藥用價值16-17
• 1.2.3 景天酸代謝模型17
• 1.2.4 胎生繁殖植物模型17-18
• 1.3 轉基因技術18-19
• 1.3.1 轉基因技術簡介18
• 1.3.2 常見轉基因方法18-19
• 1.4 植物抗旱生理19-22
• 1.4.1 干旱對植物生長的影響20
• 1.4.2 抗旱相關生理生化指標20-22
• 1.4.2.1 干旱脅迫對相對含水量、葉水勢的影響20
• 1.4.2.2 干旱脅迫對活性氧代謝的影響20-21
• 1.4.2.3 干旱脅迫對丙二醛代謝的影響21
• 1.4.2.4 干旱脅迫對光合作用的影響21-22
• 1.5 研究目的、內容與技術路線22-24
• 1.5.1 研究目的22
• 1.5.2 研究內容22-23
• 1.5.3 技術路線23-24
• 2 材料與方法24-33
• 2.1 試驗材料24-25
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 生化試劑24
• 2.1.3 主要儀器設備24
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配制24-25
• 2.2 亞細胞定位25-27
• 2.2.1 引物設計25
• 2.2.2 亞細胞定位載體3302Y-KDSAHH構建25-26
• 2.2.3 EHA105農桿菌感受態(tài)制備26-27
• 2.2.4 轉化農桿菌感受態(tài)27
• 2.2.5 本生煙草瞬時表達27
• 2.3 干旱脅迫下KDSAHH的表達分析27-29
• 2.3.1 大葉落地生根自然干旱處理27
• 2.3.2 大葉落地生根cDNA的合成27-28
• 2.3.3 引物設計28
• 2.3.4 半定量RT-PCR28-29
• 2.4 煙草轉化29-31
• 2.4.1 植物表達載體PZH01-KDSAHH構建29
• 2.4.2 煙草無菌苗種植29
• 2.4.3 煙草葉盤法轉化29-30
• 2.4.4 再生植株陽性檢測30-31
• 2.5 轉基因煙草植株干旱脅迫下生理指標測定31-33
• 2.5.1 葉片相對含水量31-32
• 2.5.2 葉綠素含量32
• 2.5.3 丙二醛含量32
• 2.5.4 過氧化物酶含量32-33
• 3 結果與分析33-43
• 3.1 KDSAHH的亞細胞定位33-34
• 3.1.1 KDSAHH的亞細胞定位結果33-34
• 3.1.2 小結34
• 3.2 干旱脅迫下KDSAHH的表達分析34-36
• 3.2.1 干旱脅迫下KDSAHH的表達34-35
• 3.2.2 小結35-36
• 3.3 植物表達載體PZH01-KDSAHH的構建及煙草轉化36-39
• 3.3.1 植物表達載體PZH01-KDSAHH的構建36
• 3.3.2 煙草轉化36-37
• 3.3.3 再生植株陽性檢測37-38
• 3.3.4 小結38-39
• 3.4 干旱脅迫下的生理指標分析39-43
• 3.4.1 干旱脅迫下的生理表現39
• 3.4.2 干旱脅迫下的生理指標39-41
• 3.4.3 小結41-43
• 4 總結與展望43-45
• 4.1 總結43
• 4.2 展望43-45
• 參考文獻45-51
• 個人簡介51-53
• 導師簡介53-55
• 致謝55

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1 劉建華;大葉落地生根是營養(yǎng)繁殖的好材料[J];生物學通報;2002年10期

2 游義霞;黃先忠;鄭銀英;崔百明;;大葉落地生根STM基因植物表達載體構建及煙草轉化[J];石河子大學學報(自然科學版);2012年03期

3 ;[J];;年期

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1 王一U，

本文編號：360750