胰腺癌是一種高度惡性腫瘤,胰腺癌的治療面臨著手術(shù)根除率低、預(yù)后極差及化療耐藥的難題。深入研究胰腺癌的分子發(fā)病機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)是解決胰腺癌治療困難的前提。DNA甲基化作為真核生物DNA最常見的修飾方式,與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)失活是促進(jìn)腫瘤形成的重要原因。因此,尋找到能夠作為胰腺癌治療新靶點(diǎn)的DNA甲基化基因是改善胰腺癌治療困難的一種新途徑。在本研究中,我們通過(guò)生物信息分析的方法預(yù)測(cè)了13個(gè)在胰腺癌中異常高甲基化低表達(dá)的基因。通過(guò)對(duì)胰腺癌患者腫瘤組織和正常組織基因表達(dá)水平及甲基化水平的檢測(cè),我們鑒定出IRX6這一抑癌基因在胰腺癌中異常高甲基化,這種異常高甲基化使它的表達(dá)受到抑制。為了進(jìn)一步研究IRX6在胰腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,我們通過(guò)慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建了IRX6過(guò)表達(dá)及knock-down穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,外源性過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中的IRX6,細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力顯著降低,反之,下調(diào)的IRX6表達(dá)后細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力顯著升高。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IRX6表達(dá)量的改變導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)吉西他濱藥物的... 

【文章來(lái)源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 胰腺癌的治療現(xiàn)狀
    1.2 DNA甲基化的基本功能
    1.3 DNA甲基化與腫瘤
    1.4 DNA甲基化靶向治療研究現(xiàn)狀
    1.5 本文研究?jī)?nèi)容
2 胰腺癌異常高甲基化基因的篩選
    2.1 材料與方法
        2.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源
        2.1.2 生物信息分析路線
        2.1.3 數(shù)據(jù)處理
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 異常高甲基化基因
        2.2.2 差異高甲基化低表達(dá)基因
        2.2.3 基因表達(dá)腫瘤差異性分析
3 IRX6在胰腺癌中異常高甲基化低表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 胰腺癌石蠟組織及組織芯片
        3.1.2 細(xì)胞株及其培養(yǎng)
        3.1.3 主要儀器及耗材
        3.1.4 主要試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 引物的設(shè)計(jì)
        3.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.3 細(xì)胞的去甲基化處理
        3.2.4 細(xì)胞總RNA的抽提
        3.2.5 RNA的逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)
        3.2.7 組織芯片免疫組化(IHC)
        3.2.8 石蠟包埋組織中DNA的提取
        3.2.9 亞硫酸氫鹽修飾DNA及回收
        3.2.10 甲基化特異性PCR(MS-PCR)
        3.2.11 瓊脂糖電泳
        3.2.12 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 IRX6在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)失活
        3.3.2 IRX6在胰腺癌組織中表達(dá)失活
        3.3.3 IRX6在胰腺癌組織中異常高甲基化
        3.3.4 去甲基化使IRX6在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)上升
4 IRX6在胰腺癌細(xì)胞中的抑癌作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 慢病毒表達(dá)載體
        4.1.2 主要儀器耗材
        4.1.3 主要試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 IRX6過(guò)表達(dá)及shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選
        4.2.2 細(xì)胞總蛋白的提取
        4.2.3 SDS-PAGE 及 Western blot
        4.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)
        4.2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        4.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
        4.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 IRX6抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力
        4.3.2 IRX6提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性
        4.3.3 IRX6抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力
        4.3.4 IRX6作用于胰腺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 縮略詞表
附錄B RT-PCR引物
附錄C IRX6MS-PCR及PCR引物
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]腫瘤微環(huán)境中的甲基化調(diào)節(jié)機(jī)制（英文）[J]. Meng-wen ZHANG,Kenji FUJIWARA,Xu CHE,Shu ZHENG,Lei ZHENG.  Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2017(05)
[2]基因組學(xué)與表觀遺傳學(xué)在腫瘤標(biāo)志物研究中的應(yīng)用[J]. 熊凱,薛麗香.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2014(01)
[3]DNA甲基化與癌癥[J]. 韓競(jìng)男,魯昊騁,梁靜.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2012(02)

博士論文
[1]PCDH8和LRRC55基因異常甲基化在胰腺癌發(fā)病中的作用研究[D]. 呂順莉.第二軍醫(yī)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3579011