蘋果果銹是一種非侵染性生理病害,在我國多數(shù)蘋果產(chǎn)區(qū)和多數(shù)主栽品種中均有發(fā)生,對蘋果的產(chǎn)量以及品質(zhì)造成嚴重影響。目前,對蘋果果實套袋是防止果銹發(fā)生的有效措施之一,但該措施不利于我國蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。開展蘋果中參與果銹形成的關(guān)鍵基因挖掘及其功能研究工作,對于進一步創(chuàng)制無銹蘋果新種質(zhì)具有重要意義。前人研究結(jié)果表明,果銹的發(fā)生與木質(zhì)素和木栓質(zhì)的積累有關(guān),并且篩選得到一些調(diào)控木栓質(zhì)生物合成的轉(zhuǎn)錄因子,但對于果銹中調(diào)控木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子還未見報道。本研究以花后30 d、60 d和150 d的套袋和非套袋‘金冠’蘋果為試材,利用組織學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學以及關(guān)聯(lián)分析,并且針對篩選得到的調(diào)控木質(zhì)素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子進行功能驗證,得出的主要研究結(jié)果如下:1.組織學分析結(jié)果表明,套袋‘金冠’無果銹產(chǎn)生,而非套袋‘金冠’蘋果在花后30 d時果皮開始形成微裂隙,表皮細胞開始破裂;在花后60 d時微裂隙進一步加深,形成“V”型裂痕,果銹組分開始積累;在花后150 d時“V”型裂縫變得更長、更深,果銹成分大量沉積。2.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,三個時期共有的DEGs為273個,其中有77個上調(diào)表達,196個... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)錄組建庫測序和基本的分析過程

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析篩選蘋果果銹形成相關(guān)基因15圖2-2蛋白質(zhì)組實驗步驟Fig.2-2Theexperimentprocedureofproteome2.1.5.2蛋白提娶質(zhì)控、酶解1)稱取0.8g左右果皮，剪碎后分裝到2mL小離心管中，隨后加10%PVPP和5mm磁珠，再加1.5mLLysisBuffer、1mM的PMSF、2mM的EDTA，置于冰上5min后，加入終濃度為10mMDTT；2)利用組織研磨儀破碎組織（功率=60HZ，time=120s），取出磁珠，25,000g離心20min；3)將上清液移入50mL離心管中，加5倍體積的冷TCA和終濃度為10mM的DTT，破碎沉淀并于-20°C靜置2h，次日離心，留沉淀；4)將上述沉淀移入2mL離心管中，加1mL冷丙酮、終濃度10mMDTT，于-20℃放置30min后，離心棄上清；5)重復（4）三次至上清無色；6)加一顆5mm磁珠，采用組織研磨儀震蕩蛋白液（time=120S、功率=40HZ），離心取上清；7)加終濃度10mMDTT，56℃水浴1h，加終濃度55mMIAM黑暗放置45min；8)加5倍體積的冷丙酮沉淀樣品2h，離心后棄上清；9)風干沉淀并加入Buffer溶解；10)采用組織研磨儀震蕩蛋白液（time=120s、功率=40HZ），離心，上清液即為蛋白質(zhì)溶液。11)酶標儀下讀取每個樣品的OD595數(shù)值，用以檢測蛋白濃度。12)每個樣品取100μg蛋白溶液，按蛋白:酶=40:1的比例加入2.5μg酶，37℃酶解4h，并利用StrataX柱除鹽。2.1.5.3肽段標記及分組

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析篩選蘋果果銹形成相關(guān)基因17iTRAQ數(shù)據(jù)的定量采用華大自主研發(fā)的IQuant（WENetal.,2014）軟件。首先在譜圖/肽段水平進行1%FDR的過濾（PSM-levelFDR≤0.01），從而獲得顯著性鑒定的譜圖和肽段列表。隨后利用肽段進行蛋白組裝，并產(chǎn)生一系列的蛋白組。在蛋白水平上以FDR1%再次進行過濾（Protein-levelFDR≤0.01）以控制蛋白的假陽性率，。表2-3IQuant定量參數(shù)Table2-3IQuantquantitationparametersItemValueQuant_peptideUseAllUniquepeptideQuant_numberAtleastoneuniquespetraProtein_RatioWeightedaverageStatisticalAnalysisPermutationTests2.1.5.7差異蛋白GO富集及Pathway富集分析在單個樣品中，定義FC≥1.2，并且Q-value＜0.05的蛋白為DEP。對多次重復試驗數(shù)據(jù)，最終差異蛋白需至少在2次重復數(shù)據(jù)中被定義為差異蛋白。對于DEPs的GO富集分析，利用顯著差異蛋白和全部鑒定得到的蛋白進行比對之后，再使用超幾何檢驗篩選顯著富集的GOterm；差異蛋白的Pathway富集分析原理類似于此。超幾何檢驗的公式與DEPs的pvalue計算方法一致。2.1.6轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學關(guān)聯(lián)分析蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析的基本原理為中心法則，基于基因表達信息流情況，在mRNA水平以及蛋白質(zhì)水平開展測序工作，然后將兩組學的數(shù)據(jù)進行整合分析，觀測基因表達過程。基于數(shù)據(jù)不同分類和關(guān)聯(lián)層次的不同，關(guān)聯(lián)分析流程如圖2-3所示。圖2-3關(guān)聯(lián)分析流程圖Fig.2-3Procedureforcorrelationanalysisofproteomeandtranscriptome

【參考文獻】：
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