目的:CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)已經(jīng)開(kāi)創(chuàng)了基因編輯的新紀(jì)元,在生物學(xué),醫(yī)學(xué),農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。但Cas9核酸酶在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)會(huì)引起脫靶效應(yīng),并可能在體內(nèi)觸發(fā)免疫反應(yīng)。為了控制Cas9蛋白在胞內(nèi)持續(xù)表達(dá),實(shí)現(xiàn)“適量就好”的Cas9蛋白表達(dá)模式,我們構(gòu)建了一種“自我調(diào)控型CRISPR系統(tǒng)”,實(shí)現(xiàn)在不改變靶基因編輯效率前提下,降低脫靶效應(yīng)。方法:我們選取程序性死亡受體1基因（PD-1）為靶基因,對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的基因編輯質(zhì)粒pX458-s3質(zhì)粒（含有識(shí)別PD-1基因gRNA序列）進(jìn)行改造,選取緊鄰Cas9基因CAG啟動(dòng)子兩端的兩個(gè)酶切位點(diǎn)（Age I和Kpn I）,分別在這兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入與靶基因gRNA的一致序列,構(gòu)建出自我調(diào)控型基因編輯系統(tǒng)（SR-CRISPR質(zhì)粒）。我們將SR-CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,少量表達(dá)的Cas9蛋白與靶向PD-1基因的gRNA形成Cas9-gRNA蛋白復(fù)合物,在切割靶位點(diǎn)PD-1基因同時(shí),可以識(shí)別Cas9基因啟動(dòng)子兩端插入的gRNA識(shí)別序列并進(jìn)行切割,導(dǎo)致啟動(dòng)子被切除,終止Cas9基因的轉(zhuǎn)錄,抑制Cas9蛋白過(guò)量表達(dá),從而降低... 

【文章來(lái)源】：廣東藥科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：97 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ZFNs的脫靶示意圖

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2特異性識(shí)別DNA的復(fù)合體相結(jié)合，誘導(dǎo)FokⅠ在靶基因處產(chǎn)生DSB，通過(guò)HDR或NHEJ修復(fù)方式對(duì)靶基因進(jìn)行編輯。TALENs和ZFNs人工核酸酶技術(shù)一樣，都是由核酸內(nèi)切酶FokⅠ和DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行融合形成的[16]。跟ZFNs相比，TALENs的編輯效率和ZFNs不相上下，但是脫靶率會(huì)顯著降低[17]，因?yàn)門ALENs的每個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列僅識(shí)別一個(gè)堿基[18]（圖1-2）[8]。目前TALENs已成功編輯了酵母、水稻、人類體細(xì)胞的內(nèi)源性基因[19-21]。圖1-2TALENs的脫靶示意圖Figure1-2Theschematicdiagramofoff-targetTALENs圖引自何秀斌,谷峰.基因組編輯脫靶研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2017,33(10):1757-1775.1.2CRISPR-Cas9系統(tǒng)介紹及作用原理2013年，一種不依賴于FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術(shù)—ClusteredregularlyInterspacedshortpalindromicrepeats/associatednuclease9(CRISPR-Cas9)[1]開(kāi)啟了基因編輯的新篇章。CRISPR-Cas9因其操作簡(jiǎn)單、方便快捷的特點(diǎn)，一問(wèn)世就受到大家的青睞，迅速超越上一代的ZFNs和TALENs技術(shù)[22]。CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中的一種天然免疫系統(tǒng)，可以用來(lái)有效的抵抗噬菌體或外源性質(zhì)粒的侵害。CRISPR/Cas系統(tǒng)由前導(dǎo)序列、間隔片段串聯(lián)序列、高度保守的重復(fù)片段及CRISPR相關(guān)蛋白基因組成。根據(jù)基因序列及核心要素的不同，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分成：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型這3種類型[23]，CRISPR-Cas9系統(tǒng)屬于Ⅱ型，由反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)、crRNA和Cas9蛋白組成，CRISPR-Cas9系統(tǒng)需crRNA和tracrRNA共同引導(dǎo)，才能對(duì)外源DNA進(jìn)行識(shí)別并切割，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的改造，將tracrRNA和crRNA序列整合成一條單鏈RNA，即單個(gè)向?qū)NA(SingleguideRNA,gRNA)，就能同時(shí)發(fā)揮反式激活crRNA和cr

制它進(jìn)入臨床應(yīng)用的最大障礙之一[26,27]，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異性主要是取決gRNA的識(shí)別序列，由于人類基因組極為復(fù)雜，設(shè)計(jì)的gRNA可與非靶向DNA局部發(fā)生匹配，這種局部匹配同樣也會(huì)使Cas9內(nèi)切酶活性被激活，從而導(dǎo)致在非靶基因處切割DNA進(jìn)而產(chǎn)生Indel突變，即脫靶效應(yīng)（off-targeteffects）（圖1-3）[8]。此外，Cas9還可以識(shí)別非標(biāo)準(zhǔn)PAM，這也會(huì)導(dǎo)致一定程度的脫靶。早在2013年就有研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)不同基因的gRNA，都會(huì)導(dǎo)致不同程度的脫靶效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注CRISPR-Cas9系統(tǒng)的靶向性和安全性[28]。圖1-3CRISPR-Cas9的脫靶示意圖Figure1-3Theschematicdiagramofoff-targetCRISPR-Cas9圖引自何秀斌,谷峰.基因組編輯脫靶研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2017,33(10):1757-1775.近年來(lái)，研究者從影響靶向精確性的各方面入手對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，以期盡可能降低脫靶率[29]�，F(xiàn)已有多種脫靶效應(yīng)的優(yōu)化策略，如改變gRNA[30-32]或PAM序列的長(zhǎng)度[25]，提高gRNA特異性，改變Cas9蛋白構(gòu)象，控制Cas9-gRNA用量，運(yùn)用Cas9酶的“關(guān)閉開(kāi)關(guān)”，減少Cas9蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的豐度等[26,27]。2019年，Charles團(tuán)隊(duì)在gRNA上添加了一條能與自身折疊形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)的尾巴，只在與靶向DNA序列完全匹配時(shí)才能開(kāi)鎖，從而精準(zhǔn)指導(dǎo)核

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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本文編號(hào)：3547336