目的建立單核細胞特異性KCNQ1基因條件敲除小鼠模型,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建痛風(fēng)氣囊模型,探討KCNQ1參與痛風(fēng)發(fā)病的具體致炎機制。方法利用條件性基因敲除技術(shù)flop^-/--loxp系統(tǒng)構(gòu)建KCNQ1^flop/flop小鼠,與單核細胞內(nèi)特異性表達cre酶的Lyz2-cre⁺工具鼠進行雜交,構(gòu)建單核細胞內(nèi)KCNQ1基因條件敲除小鼠（cKO小鼠）,進行繁殖及鑒定其子代小鼠基因型。western blot檢測KCNQ1蛋白在單核細胞內(nèi)的表達,驗證目的基因KCNQ1在單核細胞表達降低或無。cKO純合小鼠為實驗組,其野生型（WT）的同窩小鼠為對照組,每組小鼠6只,均為8周齡的健康雄性小鼠,檢測兩組小鼠血尿酸、肝功、腎功、血糖、血脂等生化指標(biāo)。構(gòu)建小鼠痛風(fēng)氣囊模型,整體水平觀察炎癥反應(yīng),收集滑膜液,滑膜,血清等樣本,滑膜液離心后收集沉淀,PBS重懸,炎性細胞計數(shù)以及姬姆薩染色,ELISA法檢測滑膜液及血清中炎癥因子IL-1β水平,HE染色觀察兩組小鼠滑膜病理形態(tài)學(xué)的變化,免疫組化檢測滑膜中IL-1β、IL-18、MCP-1的表達。取兩種基因... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

五n習(xí)戶Ox/fl今LyzZ一cre+小鼠基因型鑒定結(jié)果

實驗結(jié)果 實驗結(jié)果1 KCNQ1 基因條件性敲除小鼠模型構(gòu)建成功通過對子代小鼠基因型鑒定發(fā)現(xiàn)，KCNQ1flox/flox小鼠僅 583 bp 出有條帶，KCNQ1flox/+小鼠在 583bp 和 480bp 出同時有條帶，KCNQ1+/+僅在 480bp 出有條帶，如圖 1A 所示。圖 1B 結(jié)果顯示：Lyz2-Cre+小鼠在 700 bp 處有條帶，Lyz2-Cre-小鼠在僅350 bp 處有條帶。其中 157 號小鼠的基因為 KCNQ1flox/flox/Lyz2-Cre+，分離小鼠的原代單核細胞，LCM 進行體外誘導(dǎo)分化為單核/巨噬細胞，WesternBlot 結(jié)果顯示（圖 2）：KO 小鼠單核/巨噬細胞中 KCNQ1 表達明顯降低，提示通過 Lyz2-Cre，單核/巨噬細胞中 KCNQ1 基因被敲除。表明單核細胞 KCNQ1 條件敲除小鼠（KCNQ1cKO）模型構(gòu)建成功。

雙折光的晶體狀，檢測 PH 值為 7.2（圖4）。 2 KCNQ1 基因?qū)ρ仔约毎吇挠绊懩蛩猁}晶體刺激 8 小時后，小鼠滑膜液中炎性細胞數(shù)量增多，但 KO+MSU 和WT+MSU 兩組小鼠之間炎性細胞計數(shù)的差異不明顯（6.04×106±2.58×106VS 5.56×106± 2.56×106個，P=0.698，P＞0.05，圖 5） 圖 4 尿酸鹽晶體的偏振光顯微鏡下形態(tài)（×2

【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進展[J]. 孔維健,常宇鑫,昝春芳,鄭爽,楊小玉.  中國實驗診斷學(xué). 2017(12)
[2]2016中國痛風(fēng)診療指南[J]. 曾小峰,陳耀龍.  浙江醫(yī)學(xué). 2017(21)
[3]NALP3炎性體與非感染性炎癥疾病[J]. 童玉娜,何婭妮.  生理科學(xué)進展. 2011(04)
[4]KCNQ1通道的結(jié)構(gòu)和功能[J]. 景紅娟,何光源.  中國藥理學(xué)通報. 2007(12)
[5]KCNQ1多效性研究進展[J]. 何裕嵩,夏敏,陳義漢.  中國分子心臟病學(xué)雜志. 2005(02)

博士論文
[1]原發(fā)性痛風(fēng)易感基因KCNQ1基因的單核苷酸多態(tài)性對基因表達及單核細胞功能影響的研究[D]. 王靜.青島大學(xué) 2017



本文編號：3541117