發(fā)布時(shí)間：2021-12-17 23:27

　　乳酸菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、不產(chǎn)芽孢、兼性厭氧、發(fā)酵多種碳源產(chǎn)乳酸的重要工業(yè)微生物之一,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化學(xué)品的生產(chǎn)當(dāng)中。隨著乳酸菌工業(yè)化應(yīng)用范疇的不斷拓展,乳酸菌生理生化特性、酸耐受特性,代謝途徑及產(chǎn)酸調(diào)控機(jī)理的研究受到廣泛關(guān)注。因此,建立穩(wěn)定、高效的乳酸菌基因編輯方法,借助基因編輯技術(shù)來(lái)解析代謝關(guān)鍵基因及基因網(wǎng)絡(luò)的功能,調(diào)控代謝途徑,十分必要。對(duì)乳酸菌基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展做一綜述,并對(duì)乳酸菌基因編輯技術(shù)的未來(lái)研究方向進(jìn)行展望。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

單交換同源重組

圖1 單交換同源重組雙交換基因修飾技術(shù)的改造效率受自殺質(zhì)粒調(diào)控。自殺質(zhì)粒無(wú)法在宿主菌內(nèi)復(fù)制，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率低時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響重組效率[28]。為提高重組效率，Law等[29]改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法，使用pORI質(zhì)粒(該質(zhì)粒能在有rep A基因的大腸桿菌中自我復(fù)制，在無(wú)rep A基因的乳酸菌中無(wú)法復(fù)制)構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化到含有溫敏型質(zhì)粒pVE6007(含有rep A基因，30℃穩(wěn)定復(fù)制，37℃無(wú)法復(fù)制)的乳酸菌中，先低溫培養(yǎng)使重組載體大量復(fù)制提高同源重組幾率，再高溫培養(yǎng)，篩選出完成第一次單交換的菌株，接著再轉(zhuǎn)入pVE6007，通過(guò)低溫與高溫培養(yǎng)，篩選出完成雙交換中的突變菌株。溫敏型質(zhì)粒的低溫復(fù)制、高溫失活特性能夠有效提高同源重組效率，一系列乳酸菌溫敏型質(zhì)粒被開(kāi)發(fā)出來(lái)。Maguin等[30]使用化學(xué)誘變的方法，從一株含有pGK12質(zhì)粒的乳酸乳球菌中篩選出具有溫敏型質(zhì)粒p VE6002(28℃穩(wěn)定復(fù)制，37.5℃無(wú)法復(fù)制)，構(gòu)建出了溫敏型載體pVE6004(pG+host4)。Biswas等[31]在此基礎(chǔ)上通過(guò)將pBR322復(fù)制區(qū)序列整合到pG+host4上構(gòu)建出p G+host5載體，使其在大腸桿菌中37℃能夠復(fù)制，易于獲得大量質(zhì)粒。隨后將p G+host5用于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)基因改造，發(fā)現(xiàn)同源序列長(zhǎng)度從356到2 552bp，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，同源重組效率越高，超過(guò)這個(gè)范圍，不再增加。Neu等[32]構(gòu)建了35℃穩(wěn)定復(fù)制，42℃無(wú)法復(fù)制溫敏型質(zhì)粒pTN1。Russell等[33]構(gòu)建了37℃穩(wěn)定復(fù)制，43℃不穩(wěn)定的溫敏型質(zhì)粒p TRK。單雙交換同源重組由于理論機(jī)制清楚、適用性廣、研究較多，是目前乳酸菌基因改造的主要方法[34-38]。但該方法存在同源臂長(zhǎng)，重組效率高，但構(gòu)建困難;同源臂短，則重組效率低，篩選耗時(shí)繁瑣，工作量大。

位點(diǎn)特異性重組基因修飾能夠在對(duì)基因改造的同時(shí)，不引入抗性基因，避免了抗性基因的存在對(duì)上下游基因表達(dá)的影響，安全性好，重組效率高且適用性廣，能夠在多數(shù)乳酸菌中進(jìn)行改造。但該方法還是會(huì)在染色體上留下一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)整合到染色體上仍需要借助傳統(tǒng)的同源重組方法，無(wú)法避免同源重組效率低的問(wèn)題，需要與其他方法結(jié)合來(lái)彌補(bǔ)其不足。4 基于線性DNA重組的乳酸菌基因修飾

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]ldhL-ldb0094基因敲除對(duì)保加利亞乳桿菌產(chǎn)L-乳酸的影響[J]. 王剛,肖雨,李義,劉志剛,裴成利,武麗達(dá),李艷麗,王希慶,張明磊,陳光,佟毅.  中國(guó)生物工程雜志. 2019(08)
[2]基于pGhost4系統(tǒng)保加利亞乳桿菌乙酸激酶敲除載體的構(gòu)建[J]. 張明磊,武麗達(dá),王希慶,陳光,王剛.  吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(05)
[3]Genome engineering using the CRISPR/Cas system[J]. Takuro Horii,Izuho Hatada.  World Journal of Medical Genetics. 2014(03)
[4]構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)納豆激酶的乳酸乳球菌重組菌株[J]. 馮浩,余鳳云,單鳳娟,馬婷,閆達(dá)中.  食品科學(xué). 2012(21)



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