目的構(gòu)建以eGFP作為熒光標(biāo)記的煙曲霉Bem46基因定位菌株,觀察其在煙曲霉不同形態(tài)中的定位情況,初步明確該基因?qū)O性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5表達(dá)的影響。方法運(yùn)用分子生物學(xué)方法將煙曲霉Bem46基因克隆入質(zhì)粒pUCGH,構(gòu)建熒光定位載體。原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化煙曲霉獲得該基因定位菌株并驗(yàn)證。激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在煙曲霉孢子、芽管以及菌絲狀態(tài)下分布情況。RT-PCR觀察對(duì)照菌株Ku80和ΔBem46中極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5的表達(dá)量。結(jié)果通過(guò)全基因克隆成功獲得煙曲霉Bem46基因定位菌株并經(jīng)PCR驗(yàn)證。激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光在孢子中彌散分布,在孢子即將發(fā)芽時(shí)熒光在孢子一側(cè)聚集,并隨著芽管形成,熒光在極性生長(zhǎng)的一側(cè)延伸分布于整個(gè)菌絲中,在菌絲形成側(cè)枝膨大處可見(jiàn)熒光明顯聚集。RT-PCR結(jié)果表明ΔBem46中基因Bem1、Bud5表達(dá)量均較對(duì)照菌株有所下降。結(jié)論煙曲霉Bem46基因可能同孢子發(fā)芽、菌絲發(fā)生側(cè)枝的極性生長(zhǎng)相關(guān);且該基因缺陷可影響極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5表達(dá)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2020,36(10)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

利用含有熒光定位標(biāo)記eGFP的質(zhì)粒pUCGH構(gòu)建熒光定位株載體示意圖

將Bem46基因正確成功連接入質(zhì)粒pUCGH后進(jìn)行Bem46基因測(cè)序,確保正確的基因序列被克隆。由圖2可見(jiàn)測(cè)序結(jié)果為整齊單一序列峰,且同煙曲霉基因組中Bem46基因序列比對(duì)完全符合。2.2.2 熒光定位菌株轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果

表3 煙曲霉Bem46基因熒光定位菌株驗(yàn)證使用引物及相應(yīng)片段大小Tab.3 Primer and corresponding fragment size used for identification of Bem46 gene fluorescence localization strain 引物組別 引物 Ku80(WT) Ku80 Bem46+GFP/kb I pUCGH-R No band 1.2 Bem46-KpnI-F II Hyg-Screen-F No band 1.0 Bem46-term HindIII-R III Bem46-KpnI-F 2.3kb 7.2 Bem46-term HindIII-R由表3可見(jiàn)引物I中煙曲霉Bem46定位菌株轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增條帶約1.2 kb,而對(duì)照菌株無(wú)條帶出現(xiàn),在圖3 I中轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6有正確大小的條帶,說(shuō)明有篩選標(biāo)記eGFP同目的基因Bem46相連接。引物II熒光定位菌株應(yīng)有擴(kuò)增條帶約1.0 kb,而對(duì)照菌株沒(méi)有,在圖3 II中可見(jiàn)到轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6有篩選標(biāo)記潮霉素同目的基因Bem46下游1.0 kb序列相連接。引物III擴(kuò)增整個(gè)基因、連接入的質(zhì)粒及下游1.0 kb序列,在對(duì)照菌株無(wú)質(zhì)粒的連接,條帶為2.3 kb,而在轉(zhuǎn)化子由于有質(zhì)粒連接進(jìn)入故條帶明顯增大,為7.2 kb,圖3 III中說(shuō)明轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6均為正確的轉(zhuǎn)化子,有質(zhì)粒成功連接進(jìn)入。 通過(guò)I、II和III對(duì)引物驗(yàn)證表明轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6均為構(gòu)建成功的熒光定位菌株,可用來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]煙曲霉Bem46基因敲除株構(gòu)建及其功能初步研究[J]. 李雯,李佳娟,馮文莉,馬彥.  中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2017(08)



本文編號(hào)：3532617