結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）是結(jié)核病最主要的致病菌,機(jī)體感染后,經(jīng)呼吸道、消化道在體內(nèi)擴(kuò)散,侵犯肺、腎及神經(jīng)等其他組織器官,引發(fā)活動性結(jié)核病,具有較強(qiáng)的傳染性和致病性;或者,在體內(nèi)長期潛伏形成潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection,LTBI）。每年結(jié)核病新發(fā)人數(shù)超過千萬,而因結(jié)核病死亡的人數(shù)約在140-160萬之間,覆蓋整個年齡層和所有地區(qū),引起國內(nèi)外的高度關(guān)注。近年來,多種抗生素藥物的使用,人口的全球性流動和HIV的流行,給結(jié)核病診斷與治療帶來新的危機(jī)。目前,全球有許多實(shí)驗(yàn)室正在致力于從基因組上全面解析結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病機(jī)制及在體內(nèi)的存活規(guī)律,為診斷和治療結(jié)核病提供新的思路和技術(shù)手段。本研究使用結(jié)核分枝桿菌H37Ra構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變庫,從轉(zhuǎn)座突變庫中篩選生物膜突變體,定位相關(guān)基因,并分析生物膜相關(guān)基因,為本實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌分子機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ),同時提供一種有效方便的篩選結(jié)核分枝桿菌生物膜突變體的模型和多個寶貴的生物膜突變體材料,有助于了解結(jié)核分枝桿菌生物膜形成的遺傳機(jī)制。1結(jié)核分枝桿菌H37Ra轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)??Ｆｉｇ?２?Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ?ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ??

?第一章結(jié)核分枝桿菌Ｈ３７Ｒａ轉(zhuǎn)座突變庫的建立???得效價較高的噬菌體原液，在培養(yǎng)后能夠形成大量噬菌斑（圖卜ｌｂ）。??／?＼??ａ．?ｆｅｗ?ｐｌａｑｕｅｓ?ｂ．?ｍａｎｙ?ｐｌａｑｕｅｓ??圖１－１噬菌體的擴(kuò)增??Ｆｉｇ?１－１?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｈａｇｅｓ??３．２噬菌體的篩選??調(diào)整噬菌體稀釋度，鋪板培養(yǎng)后形成數(shù)量合適且明顯的噬菌斑，一式兩份，將噬菌??體分別接種在兩塊僅含恥垢分枝桿菌的雙層瓊脂平板上，做好標(biāo)記，一塊置于３７°Ｃ恒??溫培養(yǎng)箱，另一塊置于３０°Ｃ恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)后觀察結(jié)果：３０°Ｃ培養(yǎng)的所有噬菌體均??形成圓亮透明的噬菌斑，３７°Ｃ培養(yǎng)的噬菌體有部分可以形成模糊細(xì)小的噬菌斑，多次??篩選，直至３７°Ｃ完全不形成噬菌斑（圖１－２）。最終篩選得到溫敏特性穩(wěn)定的??（ＤＭｙｃｏＭａｒＴ７噬菌體，該噬菌體能夠在３０°Ｃ生長，而３７°Ｃ完全不生長，通過Ｈｉｍａｒ轉(zhuǎn)??座子隨機(jī)插入Ｈ３７Ｒａ基因組，產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)座突變體，避免后期鑒定由于３７°Ｃ培養(yǎng)溫度??下噬菌體存活而產(chǎn)生的假陽性。??；?？?？?＿＿＿＿＿．?ｕ?＿＿０?＿＿Ｃ?—１??上丄上�。�?＿＿＿．??Ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｔ?３０°Ｃ?Ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｔ?３７°Ｃ??圖１－２溫敏型噬菌體的篩選??Ｆｉｇ?１－２?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ?ｐｈａｇｅｓ??３．３溫敏型噬菌體的富集??篩選得到穩(wěn)定的溫敏型噬菌體，刮取噬菌斑，制備得到少量原液。經(jīng)過鋪板擴(kuò)增培??１７??

?第一章結(jié)核分枝桿菌Ｈ３７Ｒａ轉(zhuǎn)座突變庫的建立???得效價較高的噬菌體原液，在培養(yǎng)后能夠形成大量噬菌斑（圖卜ｌｂ）。??／?＼??ａ．?ｆｅｗ?ｐｌａｑｕｅｓ?ｂ．?ｍａｎｙ?ｐｌａｑｕｅｓ??圖１－１噬菌體的擴(kuò)增??Ｆｉｇ?１－１?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｈａｇｅｓ??３．２噬菌體的篩選??調(diào)整噬菌體稀釋度，鋪板培養(yǎng)后形成數(shù)量合適且明顯的噬菌斑，一式兩份，將噬菌??體分別接種在兩塊僅含恥垢分枝桿菌的雙層瓊脂平板上，做好標(biāo)記，一塊置于３７°Ｃ恒??溫培養(yǎng)箱，另一塊置于３０°Ｃ恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)后觀察結(jié)果：３０°Ｃ培養(yǎng)的所有噬菌體均??形成圓亮透明的噬菌斑，３７°Ｃ培養(yǎng)的噬菌體有部分可以形成模糊細(xì)小的噬菌斑，多次??篩選，直至３７°Ｃ完全不形成噬菌斑（圖１－２）。最終篩選得到溫敏特性穩(wěn)定的??（ＤＭｙｃｏＭａｒＴ７噬菌體，該噬菌體能夠在３０°Ｃ生長，而３７°Ｃ完全不生長，通過Ｈｉｍａｒ轉(zhuǎn)??座子隨機(jī)插入Ｈ３７Ｒａ基因組，產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)座突變體，避免后期鑒定由于３７°Ｃ培養(yǎng)溫度??下噬菌體存活而產(chǎn)生的假陽性。??；?？?？?＿＿＿＿＿．?ｕ?＿＿０?＿＿Ｃ?—１??上丄上！１?＿＿＿．??Ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｔ?３０°Ｃ?Ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｔ?３７°Ｃ??圖１－２溫敏型噬菌體的篩選??Ｆｉｇ?１－２?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ?ｐｈａｇｅｓ??３．３溫敏型噬菌體的富集??篩選得到穩(wěn)定的溫敏型噬菌體，刮取噬菌斑，制備得到少量原液。經(jīng)過鋪板擴(kuò)增培??１７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Advances in the development of molecular genetic tools for Mycobacterium tuberculosis[J]. Chiranjibi Chhotaray,Yaoju Tan,Julius Mugweru,Md Mahmudul Islam,H.M.Adnan Hameed,Shuai Wang,Zhili Lu,Changwei Wang,Xinjie Li,Shouyong Tan,Jianxiong Liu,Tianyu Zhang.  Journal of Genetics and Genomics. 2018(06)
[2]海分枝桿菌mas基因的功能研究[J]. 朱江化,于佳,高謙.  微生物與感染. 2007(03)

碩士論文
[1]結(jié)核分枝桿菌生物膜形成相關(guān)基因的篩選與鑒定[D]. 劉霞.寧夏醫(yī)科大學(xué) 2013
[2]恥垢分枝桿菌突變菌株庫的建立及耐卷曲霉素突變株的篩選與性質(zhì)研究[D]. 劉雪梅.西南大學(xué) 2008



本文編號：3518036