酸性果膠裂解酶可通過β-消除反應有效降解果膠類物質(zhì),在食品工業(yè)中具有廣泛用途,尤其是果蔬汁加工業(yè),有助于果蔬汁澄清和提高出汁率。酸性果膠裂解酶主要由真菌產(chǎn)生,尤其是黑曲霉,但其天然原始菌株普遍存在產(chǎn)酶量低和產(chǎn)物雜質(zhì)多的問題,遠達不到工業(yè)需求。本研究旨在以具有低蛋白背景的安全菌株黑曲霉SH-2為表達宿主,將來自黑曲霉全基因組的5個果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）分別進行過量表達以期實現(xiàn)酸性果膠裂解酶的高效重組表達,并對重組酶的酶學性質(zhì)和其在果汁澄清方面的實際應用進行探究。主要研究內(nèi)容如下:（1）將構(gòu)成黑曲霉果膠裂解酶基因家族的5個果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD和pelF）成功克隆,并利用黑曲霉自身強啟動子（葡萄糖淀粉酶啟動子,PglaA）分別實現(xiàn)5個果膠裂解酶基因在黑曲霉SH-2中進行重組過量表達。通過酶活測定成功篩選得到兩個高表達的酸性果膠裂解酶基因pelA和pelD,轉(zhuǎn)化菌株分別為SH2-PelA和SH2-PelD,在搖瓶發(fā)酵條件下最高酶活力分別為11069.2 U/mL和8822.6 U/mL,在液體深層發(fā)酵條件下最高酶活力... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

果膠結(jié)構(gòu)簡圖

圖 1-2 果膠裂解酶作用機制Fig 1-2 The mechanism of action of pectin lyase不同基因來源的果膠裂解酶具有不同的理化性質(zhì)，部分果膠裂解酶的理化1-1 所示。總的說來，果膠裂解酶的蛋白分子量 Mw通常在 30-50 KDa 之間，于真菌的果膠裂解酶其最適反應 pH 為酸性，pH 值大多數(shù)在 3-5 范圍之間，并件下比較穩(wěn)定，但也有存在少數(shù)真菌來源的果膠裂解酶在堿性條件下比較穩(wěn)定來源的果膠裂解酶的最適反應 pH 通常偏堿性，大都在 pH 值 8-10 的范圍之間分的果膠裂解酶為中溫酶，最適反應溫度在 40 ℃到 50 ℃之間。目前也有少數(shù)文從一些嗜熱菌中分離得到了少數(shù)可耐高溫的果膠裂解酶基因。由于米氏常數(shù) K因素的影響，如底物類型、測定溫度、測定 pH 以及離子強度等，故不同來源解酶的 Km值數(shù)據(jù)差異較大，可比性不強�？偟恼f來，改善果膠裂解酶對酶極件的適應性是目前的研究熱點之一。表 1-1 部分果膠裂解酶的理化性質(zhì)

華南理工大學碩士學位論文A235為樣品吸光值變化，由測量組的吸光值減去相應對照組的吸光值得ol；N為發(fā)酵上清液樣品的稀釋倍數(shù)；反應時間為10 min；反應體系為1.5數(shù)為5倍；添加酶量為0.25 mL。含量的測定及 SDS-PAGE 蛋白電泳 法測定果膠裂解酶蛋白濃度CA Protein Assay 試劑盒測定果膠裂解酶過量表達株發(fā)酵上清液中的胞作步驟詳見試劑盒操作說明書。牛血清（BSA）蛋白濃度標準曲線如相關(guān)性良好。


本文編號：3514506