CRISPR/Cas系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌,對入侵的病毒或噬菌體DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫機(jī)制,設(shè)計開發(fā)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已經(jīng)成為真核生物基因編輯的主流工具,在擬南芥、水稻等高等植物的基因組功能研究中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。本研究以中國鵝掌楸纖維素合酶（Cellulose synthase,CESA）為研究對象,首次構(gòu)建了具有表達(dá)中國鵝掌楸纖維素合酶（Cellulose synthase,CESA）gRNA（guide RNA）的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng),以LcCESA1基因外顯子5’端的第一個外顯子區(qū)域的GN19NGG序列設(shè)計gRNA引物;以p201N-Cas9為載體,Gibson Assembly誖Master Mix為連接酶,通過Gibson Assembly連接技術(shù),將CESA1-gRNA連入p201N-Cas9中,獲得p201N-Cas9-CESA1-gRNA載體。根據(jù)載體中插入序列,設(shè)計了兩對檢測引物,經(jīng)PCR鑒定,均獲得了相應(yīng)大小的序列;測序分析進(jìn)一步證實確認(rèn)gRNA已經(jīng)完整準(zhǔn)確地連入載體。p201N-Cas9-CESA1-gRNA載... 

【文章來源】：分子植物育種. 2017,15(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒及其PCR檢測電泳分析

(hairpin)的部分堿基序列重疊。表1所用引物序列Table1Theprimersequences引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')TCAAGCGAACCAGTAGGCTTGAAACGAGTTCGTAATGATTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACAATCATTACGAACTCGTTTCACATGCACCTAATTTCACTAGATGTGTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG引物名稱PrimernamegRNA-FgRNA-RUbi3p218(F)ISceIR(R)中國鵝掌楸纖維素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)的gRNA表達(dá)載體構(gòu)建ExpressionVectorConstructionofCelluloseSynthasegRNAWithCRISPR/Cas9GeneKnockoutSystemofL.chinense圖2p201N-Cas9-CESA1-gRNA載體結(jié)構(gòu)Figure2p201N-Cas9-CESA1-gRNAcarrierstructure2197

Cas系統(tǒng)來進(jìn)行基因組的定點編輯(Lietal.,2013;Nekrasovetal.,2013)。但CRISPR/Cas系統(tǒng)在鵝掌楸基因編輯中的應(yīng)用暫時還未見報道。本研究利用克隆獲得中國鵝掌楸(Liriodendronchinense)纖維素合酶1(CESA1)基因序列，設(shè)計CESA1-gRNA,建立一步法獲得表達(dá)gRNA的p201N-Cas9載體，作為后期鵝掌楸纖維素合酶基因編輯研究的載體工具。1結(jié)果與分析1.1PCR檢測本試驗選取對1號單克隆菌液提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2組引物均可以擴(kuò)增得到相應(yīng)大小的片段，與預(yù)期的條帶大小一致，證實其為陽性重組子(圖1)。1.2測序基因編輯的效率與gRNA序列有關(guān)。將陽性菌液送樣測序，重復(fù)測序3次，證實插入的gRNA序列圖1重組質(zhì)粒及其PCR檢測電泳分析注:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1和2代表p201N-Cas9-CESA1-gRNA質(zhì)粒;3和4分別代表引物1和引物2Figure1RecombinantplasmidanditsPCRdetectionelec-trophoresisanalysisNote:M1:DL15000DNAmarker;M2:DL2000DNAmarker;1and2representedp201N-Cas9-CESA1-gRNAplasmid;3and4representedprimer1andprimer22196

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 蒲強(qiáng),羅嘉,沈林園,李強(qiáng),張誼,張順華,朱礪.  中國生物工程雜志. 2015(11)
[2]CRISPR-Cas系統(tǒng)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 康峰,盧勝明,張海峰.  實驗動物科學(xué). 2014(04)
[3]CRISPR-Cas介導(dǎo)的基因編輯工具[J]. 左其生,李東,張亞妮,李碧春.  生物技術(shù)通報. 2014(07)
[4]基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組定點修飾新技術(shù)[J]. 王夢瑤,楊亦農(nóng),邊紅武.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2014(05)
[5]CRISPR-Cas基因組改造技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 顏雯,李海濤,向華,王曉虎.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(02)
[6]一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)[J]. 劉思也,夏海濱.  中國生物工程雜志. 2013(10)
[7]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[8]CRISPR結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 楊超杰,邱少富,宋宏彬.  軍事醫(yī)學(xué). 2013(02)
[9]成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR的研究進(jìn)展[J]. 王麗麗,何進(jìn),王階平.  微生物學(xué)報. 2011(08)
[10]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化[J]. 李鐵民,杜波.  遺傳. 2011(03)

碩士論文
[1]鵝掌楸紙漿林種源選擇與生長過程研究[D]. 駱羿.中南林業(yè)科技大學(xué) 2007



本文編號：3507183