目的利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除小鼠源肝癌細(xì)胞H22中的GP73基因,構(gòu)建H22細(xì)胞GP73基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株。方法根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)2條特異性識(shí)別GP73基因啟動(dòng)子的上下游sgRNA,利用載體p X459質(zhì)粒,構(gòu)建2對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)酶切和測序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H22細(xì)胞內(nèi),使用嘌羅霉素加壓篩選穩(wěn)定敲除GP73的H22細(xì)胞株,利用免疫印跡檢測重組質(zhì)粒對(duì)內(nèi)源GP73的敲除效果。MTT實(shí)驗(yàn)檢測GP73被敲除后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響,再利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果免疫印跡結(jié)果說明敲除GP73基因的小鼠源H22細(xì)胞株內(nèi)無GP73蛋白的表達(dá);并且GP73被敲除后,H22細(xì)胞的增殖能力和遷移能力減慢。結(jié)論通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了靶向GP73基因的重組質(zhì)粒,并且篩選出了穩(wěn)定干擾GP73表達(dá)的細(xì)胞株,從而為探討GP73在肝癌發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學(xué). 2016,40(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA靶點(diǎn)的選擇及寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)
        1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒p X459-sgRNA構(gòu)建
        1.2.3 H22細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        1.2.4 H22細(xì)胞GP73基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的單克隆篩選
        1.2.5 提取細(xì)胞基因組DNA及測序結(jié)果
        1.2.6 H22細(xì)胞GP73基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株免疫印跡檢測
        1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
        1.2.8 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 p X459-sgRNA載體的構(gòu)建
    2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒p X459-sgRNA的測序結(jié)果
    2.3 免疫印跡檢測H22細(xì)胞GP73基因敲除細(xì)胞株內(nèi)GP73蛋白的表達(dá)及測序確定突變位點(diǎn)
    2.4 H22/GP73-KO細(xì)胞的遷移能力檢測
    2.5 H22/GP73-KO細(xì)胞的增殖速度檢測
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