目的利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除小鼠源肝癌細胞H22中的GP73基因,構建H22細胞GP73基因敲除的穩(wěn)定細胞株。方法根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計原則,設計2條特異性識別GP73基因啟動子的上下游sgRNA,利用載體p X459質粒,構建2對重組真核表達質粒。經(jīng)酶切和測序鑒定后,將重組質粒轉染至H22細胞內(nèi),使用嘌羅霉素加壓篩選穩(wěn)定敲除GP73的H22細胞株,利用免疫印跡檢測重組質粒對內(nèi)源GP73的敲除效果。MTT實驗檢測GP73被敲除后對細胞增殖能力的影響,再利用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結果免疫印跡結果說明敲除GP73基因的小鼠源H22細胞株內(nèi)無GP73蛋白的表達;并且GP73被敲除后,H22細胞的增殖能力和遷移能力減慢。結論通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了靶向GP73基因的重組質粒,并且篩選出了穩(wěn)定干擾GP73表達的細胞株,從而為探討GP73在肝癌發(fā)生中的作用奠定基礎。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學. 2016,40(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA靶點的選擇及寡核苷酸鏈設計
        1.2.2 重組真核表達質粒p X459-sgRNA構建
        1.2.3 H22細胞的培養(yǎng)與轉染
        1.2.4 H22細胞GP73基因敲除穩(wěn)定細胞株的單克隆篩選
        1.2.5 提取細胞基因組DNA及測序結果
        1.2.6 H22細胞GP73基因敲除穩(wěn)定細胞株免疫印跡檢測
        1.2.7 細胞劃痕實驗
        1.2.8 MTT細胞增殖實驗
    1.3 統(tǒng)計學分析
2 結果
    2.1 p X459-sgRNA載體的構建
    2.2 重組真核表達質粒p X459-sgRNA的測序結果
    2.3 免疫印跡檢測H22細胞GP73基因敲除細胞株內(nèi)GP73蛋白的表達及測序確定突變位點
    2.4 H22/GP73-KO細胞的遷移能力檢測
    2.5 H22/GP73-KO細胞的增殖速度檢測
3 討論



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