CRISPR/Cas9是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的獲得性免疫系統(tǒng),能夠剪切外源基因,抵御病毒對(duì)細(xì)菌的入侵,最早由nakata等發(fā)現(xiàn)于1987年,直到2010年CRISPR的機(jī)制和功能才被研究清楚。在2013年,CRISPR/Cas9被整合為基因編輯工具,其中CRISPR/Cas9三個(gè)必要元素（Cas9內(nèi)切酶,crRNA和tracrRNA）可被融合為兩個(gè),通過將crRNA和tracrRNA合成為一個(gè)單鏈引導(dǎo)RNA,從而擴(kuò)大了其在基因組編輯上的運(yùn)用。因?yàn)樵摷夹g(shù)有著操作簡單、編輯效率高等優(yōu)勢(shì)得到了非常廣泛的應(yīng)用,也大大降低了基因編輯的門檻,所以我們選擇依托這項(xiàng)技術(shù)來研究靶基因自身的功能和該基因在某些疾病里的作用。本課題由兩個(gè)部分構(gòu)成,技術(shù)上都運(yùn)用了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。第一部分是通過實(shí)驗(yàn)室前期工作,發(fā)現(xiàn)KDM2A基因在哮喘模型中存在著表達(dá)量降低的現(xiàn)象,但是對(duì)該基因自身的功能和作用并不十分清楚。所以在本文中利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建KDM2A基因敲除細(xì)胞系來研究該基因的功能,并取得了如下研究結(jié)果:1.對(duì)KDM2A基因轉(zhuǎn)錄本分析和比較,選擇KDM2A-212進(jìn)行設(shè)計(jì),成功得到... 

【文章來源】：中南民族大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

1CRISPR/Cas9技術(shù)工作原理

第三章 實(shí)驗(yàn)方法3.1 KDM2A 基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建3.1.1 sgRNA 設(shè)計(jì)（1）目的基因片段選取與設(shè)計(jì)在 ensembl 數(shù)據(jù)庫中找出靶基因的外顯子區(qū)段，并將靠近起始位點(diǎn)的外子先行進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計(jì)。將選擇后的外顯子片段在麻省理工學(xué)院的 CRISDesign 軟件（http://CRISPR.mit.edu/）中進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計(jì)。根據(jù)得分高低順序此選擇 5 條 sgRNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）打靶載體利用pX458載體進(jìn)行sgRNA的完整構(gòu)建。根據(jù)載體結(jié)構(gòu)序列g(shù)RNAscaff堿基序列和酶切位點(diǎn)粘性末端合成完整引物。

4.1 敲除載體構(gòu)建將得到的重組 KDM2A-pX458 載體進(jìn)行驗(yàn)證，利用通用引物 U6 測(cè)序。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，如圖(4.1.1)黑框處表示插入的位置，經(jīng)過比較后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)正確插入載體構(gòu)建位點(diǎn)。圖 4.1.1 設(shè)計(jì)引物插入位點(diǎn)驗(yàn)證黑框空白處代表插入載體的在整個(gè)質(zhì)粒環(huán)中的位置插入位點(diǎn)的位置進(jìn)行比對(duì)分析正確后，需要確認(rèn)繼續(xù)比對(duì)該引物片段的堿和插入位點(diǎn)前后是否發(fā)生堿基圖片，由于 CRISPR/Cas9 技術(shù)的工作原理依靠基配對(duì)識(shí)別，對(duì)于測(cè)序出現(xiàn)突變的載體不能繼續(xù)使用。如圖(4.1.2)所示，經(jīng)過對(duì)后，設(shè)計(jì)的引物在插入載體后為發(fā)生任何突變。


本文編號(hào)：3480817