為了制備水牛母源基因NLRP5多克隆抗體,采用PCR擴(kuò)增水牛NLRP5基因并利用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建NLRP5表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化后的重組蛋白用于免疫小鼠,制備鼠抗NLRP5多克隆抗體,用Western blot分析該基因在水牛各組織的表達(dá)特性。結(jié)果表明:通過(guò)PCR擴(kuò)增成功克隆了水牛NLRP5基因CDS序列3 297 bp和原核表達(dá)的480 bp目的片段,成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體p ET32a-NLRP5。在誘導(dǎo)最佳條件（0.5 mmol/L IPTG,30℃誘導(dǎo)10 h）下NLRP5重組蛋白以包涵體形式表達(dá),純化復(fù)性后重組蛋白能和His標(biāo)簽特異性反應(yīng)。用該重組蛋白免疫制備獲取的鼠抗NLRP5多克隆抗體與NLRP5重組蛋白反應(yīng),效價(jià)達(dá)1∶64 000。用制備的多克隆抗體驗(yàn)證NLRP5蛋白,僅在水牛卵母細(xì)胞中特異性表達(dá),其他組織中均無(wú)表達(dá)。 

【文章來(lái)源】：黑龍江動(dòng)物繁殖. 2020,28(04)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 水牛組織、質(zhì)粒與試驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 主要試劑
    1.3 試驗(yàn)步驟
        1.3.1 引物設(shè)計(jì)
        1.3.2 總RNA的提取與cDNA的合成
        1.3.3 PCR擴(kuò)增
        1.3.4 水牛NLRP5基因序列的生物信息學(xué)分析
        1.3.5原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.3.6 重組蛋白的表達(dá)及純化
        1.3.7 免疫程序及多克隆抗體制備
        1.3.8 鼠抗NLRP5多克隆抗體的鑒定
2 結(jié)果與分析
    2.1 水牛NLRP5基因克隆和生物信息學(xué)分析
    2.2 PET32a-NLRP5表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果
    2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    2.4 NLRP5重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果
    2.5 NLRP5多克隆抗體效價(jià)
    2.6 NLRP5在水牛卵母細(xì)胞和顆粒的表達(dá)
3 討論
4 結(jié)論



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