CRISPR/Cas9是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng),經(jīng)人工改造后可對靶基因進(jìn)行修飾的技術(shù),具有構(gòu)建方法簡單、效率高、成本低、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。目前,該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌以及多種動(dòng)植物的基因組精確修飾中,是最具有臨床應(yīng)用前景的基因編輯技術(shù)。Nanog基因作為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞關(guān)鍵因子之一,對胚胎早期發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞全能性具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以青鳉為研究對象,通過使用斑馬魚密碼子優(yōu)化的Cas9編碼序列,對青鳉tyr和nanog基因進(jìn)行基因編輯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明斑馬魚密碼子優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以高效率敲除青鳉tyr和nanog基因,而且通過同源重組機(jī)制也可以介導(dǎo)青鳉nanog基因敲入�？偠灾�,青鳉CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的建立為研究青鳉nanog基因功能奠定重要的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:（1）使用CRISPR/Cas9系統(tǒng),采用單靶點(diǎn)方式敲除青鳉tyr基因。在F0代可以觀察到眼睛部位有明顯的色素缺失,并通過連續(xù)自交和表型篩選的方式快速獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的青鳉白化品系。（2）使用CRISPR/Cas9系統(tǒng),采用雙靶點(diǎn)敲除方式敲除青鳉nanog基因,測序結(jié)果表... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

青鳉胚胎顯微注射瓊脂糖預(yù)制凹槽模具

圖 2-2 青鳉胚胎顯微注射瓊脂糖凹槽示意圖Fig. 2-2 Schematic of agarose plates for medaka embryos microinjection（A）制作 1.5%瓊脂糖模具；（B）模具成型(A) Making the 1.5% mould; (B) Mould making completed青鳉顯微注射針制備胚胎絨毛膜比較厚、硬，不容易扎破。在進(jìn)行顯微注射時(shí)對顯高，需要針尖小且受力大，與常用的斑馬魚注射針相比差異較大青鳉胚胎的特點(diǎn)使用外徑 1 mm、內(nèi)徑 0.58 mm 的毛細(xì)玻璃管度陡的青鳉顯微注射針（圖 2-3），以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

圖 2-3 青鳉和斑馬魚注射針的比較Fig. 2-3 Comparison of medaka and zebrafish needles2.2.1.3 青鳉顯微注射樣品配制顯微注射技術(shù)可以將 DNA、RNA 或染料樣品注射到胚胎中。由于青鳉胚不能像斑馬魚胚胎那樣可以將注射到卵黃中的 DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中因此青鳉胚胎顯微注射時(shí)需要將 DNA 或 RNA 樣品注射到 1~2 細(xì)胞期胚胎的胞中。在配制顯微注射樣品時(shí)通常會加入終濃度為 0.2%的酚紅作為指示劑，便注射時(shí)觀察樣品注射的部位及劑量。2.2.1.4 青鳉顯微注射注射前天晚上將野生型青鳉按雌：雄=1：1 比例配對并用隔板隔開，次日微注射前 30 min 左右抽出隔板使其自然產(chǎn)卵，20 min 后收集胚胎并用鑷子去胚胎表面的黏絲清洗干凈后待用。利用 Picoliter Microinjector 注射儀將實(shí)驗(yàn)樣

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]兩種密碼子優(yōu)化的Cas9編碼基因在斑馬魚胚胎中基因敲除效率的比較[J]. 張峰華,王厚鵬,黃思雨,熊鳳,朱作言,孫永華.  遺傳. 2016(02)
[2]青鳉的生物學(xué)特性與飼養(yǎng)管理技術(shù)[J]. 黃玉瑤.  動(dòng)物學(xué)雜志. 1988(06)



本文編號：3471632