木聚糖酶是一類木聚糖降解酶系,在食品、飼料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但目前該酶的應(yīng)用受到酶活低、熱穩(wěn)定性差、不安全等因素的制約。本文通過(guò)將食品級(jí)米曲霉系統(tǒng)和產(chǎn)木聚糖酶嗜熱菌株有機(jī)結(jié)合起來(lái),為木聚糖酶基因工程方法獲得酶活高、工業(yè)成本低、安全的木聚糖酶研究提供新的思路奠定基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期保存的一株產(chǎn)木聚糖酶真菌TL01進(jìn)行形態(tài)學(xué)、18S rDNA及產(chǎn)酶鑒定,其結(jié)果表明TL01為梳棉狀嗜熱真菌,測(cè)得粗酶活為0.250?0.03 U/mL;對(duì)其兩種主要的木聚糖酶基因（xyn11A和xyl43）進(jìn)行克隆和分子生物學(xué)分析。xyn11A預(yù)測(cè)蛋白分子量24.36 kDa,等電點(diǎn)為4.77,含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列,屬于親水性蛋白,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域,其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲（44.89%）;xyl43蛋白分子量38.24kDa,等電點(diǎn)為5.23,編碼的胞內(nèi)蛋白屬于親水性蛋白,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域,無(wú)規(guī)則卷曲（59.76%）是其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（2）通過(guò)紫外誘變技術(shù)并結(jié)合表型、測(cè)序驗(yàn)證得到一株pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株RIB40△pyrG。將pyrG篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子及信號(hào)肽amyB、終止子amyBt、... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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木聚糖的結(jié)構(gòu)和木聚糖降解酶的酶切位點(diǎn)(a):木聚糖主鏈；(b):β-木糖苷酶降解低聚木糖

3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 設(shè)置不同溫度進(jìn)行真菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)真菌在 19℃不生長(zhǎng)而 56℃生長(zhǎng)，符合嗜熱真菌生長(zhǎng)特性，初步認(rèn)為菌株 TL01 是嗜熱真菌。根據(jù)真菌鑒定手冊(cè)，本實(shí)驗(yàn)將菌株 TL01分別點(diǎn)接于馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏 1 號(hào)培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基及半纖維素培養(yǎng)基，并置于 50℃靜置培養(yǎng) 3~4 d，其菌落生長(zhǎng)情況見圖 3.1A-E。該菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致，但產(chǎn)生色素情況差異很大，而且在高溫時(shí)能夠很快蔓延，在低溫培養(yǎng)時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，具體生長(zhǎng)特征見表 3.1。通過(guò)顯微鏡觀察，菌株 TL01 菌絲（圖 3.1F）疏松，孢子為球形，有隔膜，表面出現(xiàn)褶皺。其結(jié)果表明該菌株為絲狀真菌。

17表3.1不同碳源底物培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)狀況Table3.1ColonyGrowthinDifferentCarbonSourceSubstrates不同碳源底物的培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)情況菌落產(chǎn)色素情況菌落形態(tài)馬鈴薯培養(yǎng)基較好黃褐色菌落生長(zhǎng)迅速，圓狀凸出，菌落初期呈白色絨毛絮狀，后期變?yōu)榛液稚�，培養(yǎng)基背面變?yōu)辄S色，菌落中心為黃褐色高氏1號(hào)培養(yǎng)基較差-------菌落早期為絨毛狀菌絲，后期變?yōu)榛液谏�，但菌落蔓延能力較差察氏培養(yǎng)基較差-------出現(xiàn)絨毛狀白色菌絲，很少蔓延麥芽糖培養(yǎng)基較好灰黑色生長(zhǎng)初期白色菌絲生長(zhǎng)旺盛，后期出現(xiàn)中心顏色深，外沿顏色淺的同心圓淀粉培養(yǎng)基較好暗紅色菌落迅速蔓延，圓形，枕狀中凸，邊緣整齊，菌落中間顏色較深。3.2分子生物學(xué)鑒定提取嗜熱真菌TL01基因組DNA，對(duì)其ITS保守序列采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖3.2所示。擴(kuò)增得到的ITS序列750bp左右，而真菌ITS區(qū)域長(zhǎng)度一般在500~750bp，符合預(yù)期值。對(duì)擴(kuò)增得到的ITS序列采用瓊脂糖凝膠試劑盒純化，并送公司測(cè)序。圖3.2真菌TL01的ITS序列M:D2000;1:ITS序列Fig.3.2ITSsequencesoffungiTL01M:D2000;1:ITSsequence測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選擇相關(guān)序列，采用MEGA6.0軟件的最

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3469283