棗樹是中國第一大干果樹種,也是重要的藥用和經(jīng)濟林作物。真菌病害嚴重影響了棗產(chǎn)量與品質(zhì),其中鏈格孢（Alternaria alternata）是引起棗果實病害的重要病原,能夠?qū)е露喾N癥狀,如棗黑斑、棗褐皮、棗縮果等我們以其典型代表癥狀將該病害命名為棗黑斑病。2015年,鏈格孢（A.alternata）全基因組數(shù)據(jù)的公布,為其基因功能的定點研究、互作機制、致病機理等的研究奠定了基礎(chǔ)。本文采用重疊PCR技術(shù),利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法,將目的基因替換為潮霉素抗性基因hyg,敲除了棗黑斑病菌中編碼CDK8激酶模塊的SSN3、SSN8、MED12和MED13這四個蛋白的基因,通過報告基因表達的抗性篩選及PCR檢測,分別獲得了這四個蛋白編碼基因的缺失突變體,同時還得到了這四個編碼基因缺失突變體的回補菌株。通過對以上缺失突變體及其回補菌株的表型分析發(fā)現(xiàn):1)Ssn3基因缺失后,菌株生長受抑制,幾乎無氣生菌絲,產(chǎn)孢量顯著下降（-98.56%）,孢子鏈變短,無分支,只有1～3個分生孢子串生;Ssn3基因缺失菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落比野生型的顏色深,呈黑色,生長變慢,且對過氧化氫、氯化鈉及SDS的壓力脅迫比較... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻綜述
    1.1 棗黑斑病病害概述
    1.2 鏈格孢Alternaria alternata致病機理研究
        1.2.1 毒素合成相關(guān)基因
        1.2.2 機械穿透作用
        1.2.3 降解酶與Alternaria真菌致病性
        1.2.4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因
    1.3 中介體復(fù)合體(Mediator complex)的CDK8激酶模塊研究
        1.3.1 中介體復(fù)合體(Mediator complex)
        1.3.2 CDK8激酶模塊(CKM)
2 引言
3 材料與方法
    3.1 試驗材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 試劑
        3.1.4 儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 基因組DNA提取
        3.2.2 pCB1003質(zhì)粒的提取
        3.2.3 棗黑斑病菌的Ssn3、Ssn8、Med12、Med13基因DNA序列的獲得
        3.2.4 基因敲除盒的構(gòu)建
            3.2.4.1 基因敲除盒的引物設(shè)計
            3.2.4.2 Ssn3、Ssn8、 Med12、 Med13基因上下片段的獲得
        3.2.5 原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
        3.2.6 突變體的篩選
        3.2.7 缺失突變體的驗證
            3.2.7.1 轉(zhuǎn)化子DNA粗提
            3.2.7.2 轉(zhuǎn)化子檢測引物設(shè)計
        3.2.8 缺失突變體回補敲除盒的構(gòu)建
            3.2.8.1 基因缺失突變體回補策略
            3.2.8.2 突變體原生質(zhì)體制備
            3.2.8.3 突變體回補及其檢測引物的設(shè)計
            3.2.8.4 缺失突變體回補菌株的PCR驗證
        3.2.9 突變體菌落表型觀察及生長速度測量
        3.2.10 突變體產(chǎn)孢率測定
        3.2.11 突變體產(chǎn)孢情況觀察
        3.2.12 突變體耐壓性測定
        3.2.13 突變體對冬棗的致病性
        3.2.14 突變體對梨的致病性
4 結(jié)果與分析
    4.1 蛋白序列的分析鑒定
    4.2 基因敲除盒的構(gòu)建結(jié)果
        4.2.1 潮霉素片段的獲得
        4.2.2 Ssn3基因敲除盒的獲得
        4.2.3 Ssn8基因敲除盒的獲得
        4.2.4 Med12與Med13基因敲除盒的獲得
    4.3 轉(zhuǎn)化子的檢驗結(jié)果
        4.3.1 Ssn3基因的轉(zhuǎn)化子檢驗結(jié)果
        4.3.2 Ssn8基因的轉(zhuǎn)化子檢驗結(jié)果
        4.3.3 Med12基因的轉(zhuǎn)化子檢驗結(jié)果
        4.3.4 Med13基因的轉(zhuǎn)化子檢驗結(jié)果
    4.4 缺失突變體的回補
        4.4.1 Ssn3基因缺失突變體的回補
        4.4.2 Ssn8基因缺失突變體的回補
        4.4.3 Med12基因缺失突變體的回補
        4.4.4 Med13基因缺失突變體的回補
    4.5 Ssn3,Ssn8,Med12和Med13基因功能分析
        4.5.1 缺失突變體的營養(yǎng)生長情況
        4.5.2 缺失突變體產(chǎn)分生孢子的情況
        4.5.3 缺失突變體在不同壓力脅迫下耐受性
        4.5.4 缺失突變體對棗和梨果實的致病力
5. 結(jié)論與討論
    5.1 結(jié)論
    5.2 討論
參考文獻
Abstract


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]冬棗黑點病病原物分子鑒定與致病機理初探[D]. 于麗娜.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[4]蔥紫斑病重要流行環(huán)節(jié)及綜合防治技術(shù)的初步研究[D]. 溫嘉偉.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
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本文編號：3467459