本課題利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),敲除大鼠RBL-2H3細(xì)胞CnAβ基因以構(gòu)建基因敲除細(xì)胞突變株,并探討CnAβ基因?qū)w外RBL-2H3細(xì)胞活化脫顆粒的影響。設(shè)計(jì)三個(gè)單向?qū)NA（single guide RNA,sgRNA）,靶向CnAβ基因的外顯子1。以pX459質(zhì)粒為骨架構(gòu)建表達(dá)sgRNA的打靶載體。用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠RBL-2H3細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)基因敲除。在嘌呤霉素篩選后,利用PCR擴(kuò)增并測序初步檢測靶基因的敲除情況。PCR驗(yàn)證3種細(xì)胞（成功敲除的細(xì)胞KO,空載體細(xì)胞MOCK,野生細(xì)胞WT）的轉(zhuǎn)錄情況;甲苯胺藍(lán)染色檢測大鼠RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒后的形態(tài)變化;WST-1法測定細(xì)胞活力及毒性作用;IgE刺激后檢測誘導(dǎo)劑（DNP-BSA,C48/80,LPS）的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和劑量及細(xì)胞的脫顆粒情況。研究獲得具體結(jié)果如下:1.利用CRISPR/Cas9技術(shù),大鼠RBL-2H3細(xì)胞CnAβ基因被成功敲除,通過PCR擴(kuò)增檢測到完整敲除外顯子1附近381 bp（exon1整個(gè)敲除）。2.PCR擴(kuò)增3種細(xì)胞后,凝膠電泳顯示敲除成功的細(xì)胞無特異性條帶,表明敲除... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 過敏反應(yīng)
        1.1.1 過敏反應(yīng)的概述
        1.1.2 Ⅰ型過敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞
        1.1.3 Ⅰ型過敏反應(yīng)的體外篩選指標(biāo)
            1.1.3.1 Ig E/FcεRI信號(hào)通路的交聯(lián)
            1.1.3.2 鈣離子通道
            1.1.3.3 脫顆粒介質(zhì)
    1.2 RBL-2H3細(xì)胞
    1.3 鈣調(diào)磷酸酶（CaN）
        1.3.1 CaN的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 CaN在組織中的分布及其功能
    1.4 基因編輯技術(shù)
        1.4.1 鋅指核酶（ZFNs）
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子-TALENs
        1.4.3 成簇的、規(guī)律間隔的短路回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9
    1.5 本論文的研究內(nèi)容、目的及意義
        1.5.1 研究內(nèi)容
        1.5.2 技術(shù)路線
        1.5.3 研究目的及意義
第2章 基因敲除細(xì)胞突變株的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞來源
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用試劑耗材
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用引物序列
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基及主要試劑的配置
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 RBL-2H3細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代，復(fù)蘇，凍存
            2.2.1.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代
            2.2.1.2 細(xì)胞凍存
            2.2.1.3 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2.2 pCas9/gRNA的設(shè)計(jì)
        2.2.3 pCas9/gRNA-CnAβ 載體構(gòu)建
            2.2.3.1 復(fù)蘇PX459并提質(zhì)粒
            2.2.3.2 酶切實(shí)驗(yàn)
            2.2.3.3 切膠回收實(shí)驗(yàn)
            2.2.3.4 雙鏈寡核苷酸合成
            2.2.3.5 連接反應(yīng)
            2.2.3.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
            2.2.3.7 載體測序驗(yàn)證
        2.2.4 嘌呤霉素預(yù)實(shí)驗(yàn)確定藥篩陽性克隆的終濃度
        2.2.5 脂質(zhì)體3000構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系
            2.2.5.1 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系并藥篩出陽性單克隆
            2.2.5.2 陽性單克隆細(xì)胞的檢測
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 酶切結(jié)果
        2.3.2 熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
        2.3.3 酶切驗(yàn)證
        2.3.4 測序后電泳驗(yàn)證（陽性質(zhì)粒提取）
        2.3.5 陽性單克隆細(xì)胞檢測
        2.3.6 陽性單克隆序列比對
    2.4 分析與討論
    2.5 小結(jié)
第3章 CnAβ 與細(xì)胞脫顆粒的關(guān)系
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.0 PCR驗(yàn)證3種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況
            3.1.0.1 Trizol提RNA并測定濃度
            3.1.0.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA
            3.1.0.3 RT-PCR擴(kuò)增
            3.1.0.4 凝膠電泳檢測其表達(dá)
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑耗材
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用引物序列
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)用主要試劑的配置
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.2 甲苯胺藍(lán)染色
        3.2.3 細(xì)胞活力測定
        3.2.4 WST-1 檢測細(xì)胞毒性
        3.2.5 細(xì)胞脫顆粒情況
        3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄結(jié)果
        3.3.2 染色結(jié)果
        3.3.3 細(xì)胞活力
        3.3.4 細(xì)胞毒性
        3.3.5 細(xì)胞脫顆粒
            3.3.5.1 不同時(shí)間和濃度的C48/80 誘導(dǎo)3種細(xì)胞脫顆粒情況
            3.3.5.2 不同時(shí)間和濃度的DNP-BSA誘導(dǎo)3種細(xì)胞脫顆粒情況
            3.3.5.3 不同時(shí)間和濃度的LPS誘導(dǎo)3種細(xì)胞脫顆粒情況
    3.4 分析與討論
    3.5 小結(jié)
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
        4.2.1 CnAβ 對肥大細(xì)胞內(nèi)炎癥因子產(chǎn)生與分泌的影響研究
        4.2.2 CnAβ 對肥大細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)的影響研究
        4.2.3 體外過敏反應(yīng)研究
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]兒童皮膚性肥大細(xì)胞增生病12例臨床與組織病理分析[J]. 李巍,錢華,吳亞芬,魯慧,胡翠.  中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志. 2018(04)
[2]基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 李想,崔文濤,李奎.  中國畜牧獸醫(yī). 2017(08)
[3]應(yīng)用TALEN技術(shù)定點(diǎn)突變水稻苯達(dá)松抗性基因CYP81A6[J]. 姜明君,常振儀,盧嘉威,劉東風(fēng),謝剛,陳竹鋒,唐曉艷.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2016(08)
[4]基因組編輯技術(shù)為徹底清除體內(nèi)人類免疫缺陷病毒帶來曙光[J]. 魏民,邵一鳴.  微生物與感染. 2015(05)
[5]大中型動(dòng)物基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 劉雪靜,王歡,嚴(yán)放,高明明,劉國慶,黃薇.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2015(01)
[6]應(yīng)用TALEN技術(shù)對兔CCR5基因進(jìn)行靶向修飾[J]. 唐成程,張全軍,李小平,樊娜娜,楊翌,全龍泉,賴良學(xué).  遺傳. 2014(04)
[7]基因組編輯技術(shù)改良家畜的研究進(jìn)展[J]. 魏景亮,吳添文,阮進(jìn)學(xué),牟玉蓮.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 2014(01)
[8]TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)方法與流程[J]. 沈延,黃鵬,張博.  遺傳. 2013(04)
[9]一種大鼠腹腔肥大細(xì)胞分離方法[J]. 幸曉燕,王青,周聯(lián),鄧向亮.  免疫學(xué)雜志. 2011(07)
[10]肥大細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 肖淑華,劉陽陽,魏連海,郭義.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2011(02)

博士論文
[1]家兔肥大細(xì)胞的分布定位及超微結(jié)構(gòu)特征研究[D]. 呼格吉樂圖.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004

碩士論文
[1]中藥注射劑致類過敏反應(yīng)中肥大細(xì)胞脫顆粒及補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制研究[D]. 樊孟.廣東藥科大學(xué) 2017
[2]梓醇對IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的影響及其機(jī)制研究[D]. 李滿萍.暨南大學(xué) 2013
[3]山羊發(fā)情周期不同階段子宮與輸卵管內(nèi)肥大細(xì)胞消漲規(guī)律的研究[D]. 王立芹.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3446877